$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Wzrost i przygotowanie inokulacji bakteryjnej
- Rozmrozić zapasy glicerolu Helicobacter pylori (H. pylori) lub H. felis w temperaturze -80 °C i subkulturę na płytkach z agarem z krwią końską (HBA) zawierających: Blood Agar Base No.2 (patrz Tabela Materiałów); zmodyfikowany "Skirrow's antibiotic selective supplement" (składający się z wankomycyny, 10 μg/ml; polimyksyna B, 25 ng/ml; trimetoprim, 5 μg/ml; amfoterycyna B, 2,5 μg/ml); i 5–10% (v/v) krwi końskiej. Bakterie dobrze rozwijają się w warunkach mikrotlenowych w słoikach beztlenowych o pojemności 2,5 lub 3,5 litra zawierających odpowiednie pakiety gazowe (patrz tabela materiałów), w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Szczepy H. pylori uprawiane w tych warunkach muszą być subhodowane po 1–1,5 dniu inkubacji, podczas gdy w przypadku H. felis zazwyczaj wymagane są co najmniej 2 dni inkubacji. Odpowiednie podłoża hodowlane i magazynujące zostały szczegółowo opisane wcześniej.
- Przygotować inokulum bakteryjne do zakażenia myszy z kultur wczesnej i środkowej fazy logarytmicznej. Delikatnie zbierz bakterie z płytek agarowych, zalewając każdą płytkę 1-2 ml bulionu z naparu z serca (BHI). Odessać zawiesiny z płytek za pomocą pipet Pasteura.
- Alternatywnie przygotuj inokulum z bakterii Helicobacter, które rozmnażały się w bulionie BHI przez 16–18 godzin. W takim przypadku należy zebrać bakterie przez odwirowanie na niskiej prędkości przy 2 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Oceń żywotność i ruchliwość bakterii, badając preparaty do montażu na mokro pod mikroskopią kontrastu fazowego (obiektyw 100X). Przygotuj mokre mocowania, ponownie zawieszając pętlę bakterii w kropli bulionu BHI o objętości 10–20 μl na szklanym szkiełku mikroskopowym. W przypadku H. felis, która jest znacznie większą bakterią niż H. pylori, należy użyć hemocytometru, aby dokładnie policzyć liczbę żywotnych bakterii. Potwierdź czystość hodowli, wykonując barwienie metodą Grama.
nuta: Szczepionkę H. pylori należy stosować tylko wtedy, gdy większość bakterii ma kształt pałeczki lub spirali (morfologia może się różnić w zależności od szczepu). Szczepionka H. felis powinna zawierać przede wszystkim bakterie o kształcie spiralnym.Nie używaj inokulantu, jeśli większość bakterii ma morfologię kokoidalną, ponieważ te formy nie są żywotne i nie wywołają infekcji u myszy.
- Oszacuj liczbę bakterii w inokulum, licząc pod mikroskopią z kontrastem fazowym przybliżoną liczbę bakterii na pole (obiektyw 100X) i korzystając z następującego przewodnika: 1 bakteria na pole = około 106 jednostek tworzących kolonie (CFU) Helicobacter/ml; 10 bakterii na pole = około 10,7 jtk/ml; 100 bakterii na pole = około 10,8 jtk/ml, itd.
- Używając hemocytometru, oblicz jtk CFU/ml według następującego wzoru:
CFU/ml = (średnia liczba bakterii w polu 4 x 4) x (współczynnik rozcieńczenia) x (10:4).
- Dostosuj gęstość komórek bakteryjnych inokulum do około 107–108 jtk/ml przez rozcieńczenie w bulionie BHI, jeśli to konieczne.
- Aby zapewnić maksymalną żywotność bakterii, należy jak najszybciej po przygotowaniu użyć inokulantu do zgłębnika żołądkowego.
- Gęstość i żywotność komórek H. pylori należy zawsze potwierdzać, przeprowadzając żywotne liczenie inokuli natychmiast po procedurze zgłębnika (patrz poniżej). Nie zawsze jest to możliwe w przypadku H. felis, ponieważ zwykle nie tworzy izolowanych kolonii na pożywkach hodowlanych. Liczba żywotnych bakterii Helicobacterw inokulach nie może być określona za pomocą samego pomiaru gęstości optycznej (A600), ponieważ metoda ta nie rozróżnia bakterii żywotnych (tj. pałeczek / spiralnych / spiralnych) i nieżywotnych (tj. kokoidalnych).
- Wartości gęstości optycznej należy stosować do szacowania liczby żywotnych bakterii H. pylori w inokulach, ale w tym przypadku najpierw konieczne jest wygenerowanie krzywej wzrostu. W tym celu wartości A600 w kulturach H. pylori są monitorowane w czasie i bezpośrednio korelowane z liczbą żywotnych bakterii, określaną przez liczenie płytek.
nuta: Dogodną metodą wykonywania takich oznaczeń krzywej wzrostu jest hodowla bakterii w płynnym podłożu (sekcja 1.2) przy użyciu standardowych płaskodennych kolb do hodowli tkankowych umieszczonych w inkubatorze o stężeniu 10% CO2 . Liczby jtk, oznaczone z podwielokrotności kultur otrzymywanych co 4–6 godzin przez 2–3 dni, są następnie porównywane z odpowiadającymi im wartościami A600. Co ważne, dla każdego szczepu H. pylori należy wygenerować krzywe wzrostu, ponieważ mogą one rosnąć w różnym tempie, a ponadto nie wszystkie szczepy dobrze rosną w 10% CO2 .
2. Zgłębnik śródżołądkowy myszy z Helicobacter
UWAGA: Ta metoda podawania do żołądka może być stosowana do innych gatunków bakterii, które kolonizują jelita, np. S. Typhimurium, C. rodentium, Listeria monocytogenes.
- Użyj 6-8-tygodniowych, wolnych od specyficznych patogenów (SPF) i wolnych od Helicobacter samców lub samic myszy. Do eksperymentów z zakażeniem H. pylori lub H. felis należy wykorzystać zwierzęta z tłem genetycznym C57BL/6. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy myszy typu dzikiego (WT) i genetycznie zmodyfikowane C57BL / 6 pozbawione kluczowego wrodzonego receptora odpornościowego (określane jako zwierzęta knock-out lub KO).
nuta: Myszy o innym pochodzeniu genetycznym mogą być również wykorzystywane do zakażeń Helicobacter, jednak na poziom kolonizacji i nasilenie choroby może mieć wpływ rodzaj tła gospodarza.
- Odessać inokulum bakteryjne (krok 1.5) do jednorazowych strzykawek o pojemności 1 ml i zastąpić dostarczone igły igłami o rozmiarze 23, na które przymocowane są jednorazowe cewniki polietylenowe (długość, 6–8 cm; średnica wewnętrzna, 0,58 mm). Przymocuj cewniki do igieł, nakładając małe paski folii z tworzywa sztucznego (patrz Tabela materiałów). Alternatywnie wymień zespół igły/cewnika na sterylne plastikowe rurki do karmienia (rozmiar 20 x 38 mm).
- Fizycznie przytrzymuj myszy mocnym uściskiem na karku i ogonie.
nuta: Zabieg ten można wykonać bez znieczulenia lub alternatywnie z użyciem wziewnego środka znieczulającego, takiego jak metoksyfluran lub izofluran.
- Włóż cewnik do środka otwartej szczęki i poprowadź go w kierunku doogonowym w kierunku przełyku. Przedłuż szyję myszy, aby umożliwić łatwy dostęp do żołądka przez przełyk (i z dala od tchawicy), aż większość lub całość cewnika przestanie być widoczna i wyczuwalny będzie opór, odpowiadający podstawie żołądka. Dostarczyć określoną porcję, zwykle 100 μl na inokulację (ryc. 1).
nuta: Myszy powinny być karmione ≥ 105 CFU, aby zapewnić optymalną kolonizację i patologię choroby.
