Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie cewników
- Przygotuj jedną pediatryczną kaniulę o dostępie dożylnym dla każdej grupy myszy, która ma zostać zakażona. Korzystając z wbudowanego mechanizmu sprężynowego, odłącz każdą kaniulę od igły, zgodnie z instrukcją producenta. Wyrzuć igły, zachowując tylko plastikową kaniulę dożylną.
- Sterylizuj cewniki w kapturze z przepływem laminarnym przez jeden cykl ultrafioletowy (UV), zwykle 25 - 30 min.
nuta: Cewniki mogą być używane dla więcej niż jednej myszy, jednak nowy cewnik powinien być używany między grupami eksperymentalnymi, płciami lub szczepami bakterii.
2. Przygotowanie uropatogennej Escherichia coli do infekcji
- Co najmniej dwa dni przed zakażeniem, używając sterylnej pętli do inokulacji, nanieść uropatogenną bakterię Escherichia coli (UPEC) z zamrożonego bulionu bakteryjnego na płytkę agarową z bulionu Luria (LB), zawierającą antybiotyki, jeśli to właściwe. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Talerze można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
- W sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 100 ml zaszczepić 10 ml LB, zawierającej antybiotyki, jeśli to właściwe, pojedynczą kolonią z płytki LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (około 16-18 godzin).
nuta: Stojące kultury pozwalają na ekspresję pilusów typu 1, które są niezbędne do zakażenia. Kultury wyhodowane w potrząśnięciu będą miały mniej wydajną ekspresję pilusów, a tym samym niespójne wskaźniki infekcji.
- Zmierzyć gęstość optyczną (OD)600 w nocnej hodowli i obliczyć liczbę bakterii na ml, korzystając z wcześniej ustalonej krzywej wzrostu. Na przykład dla szczepu UPEC UTI89, OD600 = 0,35 odpowiada jednostce tworzącej kolonię (CFU) 2 x 108 na ml, zatem hodowla przez noc z OD600 = 2,4 byłaby równoważna 13,7 x 108 CFU na ml. Empirycznie określ związek między OD600 a żywymi bakteriami z każdym nowym szczepem wykorzystywanym do infekcji.
- Określ liczbę potrzebnych bakterii, biorąc pod uwagę liczbę zwierząt, które mają być zakażone, oraz to, że każda mysz powinna otrzymać około 107 jednostek tworzących kolonie (CFU) w 50 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Uwzględnij w obliczeniach ~130 μl martwej objętości cewnika i wypustki strzykawki oraz 100 μl potrzebnych do określenia inokulum.
- Wirować zawiesinę bakteryjną w mikrowirówce stołowej o sile 17 000 x g przez 1 minutę i ponownie zawiesić powstałą osadkę bakteryjną w ilości 2 x 108 jtk/ml w PBS. Seryjnie rozcieńczyć porcję tej zawiesiny i ułożyć ją na płytkę na agarze LB, w razie potrzeby z antybiotykami, w celu określenia dokładnego inokulum dla każdego zakażenia.
- Narysuj inokulum bakteryjne do strzykawki o pojemności 1 ml i przymocuj cewnik do końca strzykawki. Postukać w strzykawkę, aby usunąć powietrze i wcisnąć tłok, aby wypełnić martwą przestrzeń powietrzną w cewniku przed rozpoczęciem wkraplania.
3. Przygotowanie myszy
- Znieczulenie myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny. Można zapewnić dodatkowe ciepło.
- Upewnij się, że każda mysz jest w pełni uspokojona, ściskając podnóżek ze średnim naciskiem. Myszy są w pełni uspokojone, gdy nie reagują i potrzebują 3 - 5 minut, aby osiągnąć ten stan.
- Ułóż myszy na wznak i wywieraj średni nacisk na dolną część brzucha, aby opróżnić pęcherz z moczu. Pełne pęcherze są jak ziarnko grochu pod skórą między grzebieniami biodrowymi.
nuta: Wziewny izofluran był używany do cewnikowania samic myszy, jednak nie przetestowano, czy samce myszy są wystarczająco znieczulone wziewnym izofluranem do tej procedury.
4. Przezcewkowe wkraplanie samicom myszy
- Używając ręki niedominującej, połóż kciuk na ogonie, a palec tej samej ręki na brzuchu myszy i delikatnie uciskaj w przeciwnych kierunkach, aby mocno utrzymać mysz w miejscu.
- Umieść końcówkę cewnika prostopadle do myszy przy ujściu cewki moczowej. Delikatnie uciskając wsuń cewnik do cewki moczowej, aż piasta zetknie się z ujściem cewki moczowej, jednocześnie opuszczając strzykawkę tak, aby była równoległa do powierzchni roboczej. Cewnik nie wymaga smarowania. Nie należy wciskać ani wciskać cewnika na siłę do cewki moczowej. Cewnik powinien płynnie i łatwo wsuwać się do cewki moczowej, z niewielkim lub zerowym oporem.
- Przed wkropleniem inokulum (krok 4.3), gdy cewnik jest już na miejscu, bardzo delikatnie pociągnij skórę brzucha w kierunku głowy myszy palcem z ręki niedominującej, która znajduje się już na brzuchu myszy (krok 4.1). Jeśli cewnik znajduje się w cewce moczowej, tkanka tworząca ujście cewki moczowej nie będzie się poruszać, natomiast jeśli cewnik zostanie nieprawidłowo umieszczony w pochwie, tkanka przesunie się w górę i odsunie się od cewnika. Ten szybki test należy wykonać na każdej myszy.
- Gdy piasta cewnika zetknie się z ujściem cewki moczowej, powoli dozuj 50 μl inokulum bakteryjnego. Powolne tempo wkraplania minimalizuje odpływ pęcherzowo-moczowodowy do nerki. Powoli wyjmij cewnik, aby zapobiec wyciekowi, powyżej 5 razy. Umieść myszy w klatkach w pozycji leżącej.
