Technika tworzenia modelu infekcji bakteryjnej w hodowli narządów ex vivo

Streszczenie

Źródło: Rizzuto, G. A., et al. Ludzkie hodowle łożyska i narządów dziesiętnych w celu zbadania infekcji na styku matki i płodu. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje metodę tworzenia modelu infekcji w tkankach łożyska w celu badania rozprzestrzeniania się infekcji. Posiew narządów łożyska ex vivo jest zakażony Listeria monocytogenes, fakultatywnym pasożytem wewnątrzkomórkowym. Bakterie atakują trofoblasty kosmkowe (EVT), aby dostać się do tkanki łożyska, a następnie rozmnażają się do innych komórek poprzez rozprzestrzenianie się z komórki na komórkę.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Przygotowanie płytek do hodowli organów

UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonywane przy użyciu sterylnej techniki w kapturze do hodowli tkankowej. Idealnie nadaje się, aby mikroskop sekcyjny znajdował się w sterylnym polu. Nie jest to jednak absolutnie konieczne, o ile mikrosekcja jest wykonywana szybko, a narzędzia są często zanurzane w 70% etanolu.

<....

Wyniki

Rycina 1: Hodowle narządów kosmków – reprezentatywne obrazy ogólne i mikroskopowe.

(A) Dwa końcowe kosmkowe drzewa o wieku ciążowym 6 tygodni, oglądane pod mikroskopem preparacyjnym. Zwróć uwagę na "puszyste" końce (groty strzałek) i wydatne unaczynienie płodu przepływające przez gałęzie drzewa po lewej stronie, co sprawia, że ten kawałek.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Woreczki do sterylizacji	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 01-812-54	Do autoklawowania poszczególnych narzędzi sekcyjnych
Sitko o drobnych oczkach	Cuisinart (Amazon.com)	nie	Zawiń całkowicie w folię aluminiową i autoklaw przed pobraniem tkanki.
Gąsień z czopem	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 03-007-647	Do przygotowania dużej objętości buforu do mycia.
Okłady z lodu	Laboratoria Nortech	Zobacz materiał GB8818	Nie trzeba ich kupować, można je poddać recyklingowi/ponownie wykorzystać z dowolnej rutynowej przesyłki laboratoryjnej, która zawiera je w opakowaniu.
70% etanolu	Firma VWR	Zobacz materiał V1001	70% roztwór wykonany przez dodanie dH20 do 190 lub 200 proof alkoholu klasy badawczej.
10% wybielacza	Zaopatrzenie sanitarne Waxie	CLO 30966	10% roztwór sporządzony przez dodanie dH20.
Kaseton świetlny	Litebox Lumina (dickblick.com)	55305-2009	Zwróć uwagę, że zamienne żarówki zostały również zakupione w Blick (55305.0100)
Mikro kleszcze preparacyjne	Stoelting (Stoelting)	52102-43	4 cale, 1x2 0,5 mm, lekka krzywizna
Mikro kleszcze preparacyjne	Stoelting (Stoelting)	Numer katalogowy: 52102-06	4 cale, proste, drobne, ostre
Nożyczki sprężynowe do mikro preparacji vannas	Stoelting (Stoelting)	52130-01P	Nożyczki sprężynowe McPherson-Vannas, 8.5cm, końcówka 0.33, lekka krzywizna
Mikroskop preparacyjny	Mikrosystemy Leica	MZ16 lub M60	Odnieśliśmy sukces z wymienionymi modelami. Zewnętrzne elastyczne źródła światła na gęsiej szyi są pomocne, ale nie są konieczne.
Probówki stożkowe 50 ml	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS4558
sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Gibco (ThermoFisher Scientific)	10010023	Kupujemy w naszej uniwersyteckiej placówce Tissue Culture Core, dostępne są alternatywne opcje, takie jak ta.
10X sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Teknova	Zobacz materiał P0195	Do przygotowania buforu Wash używamy 10X PBS
Mieszanka odżywcza DMEM/F-12 (szynka) z GlutaMAX	Gibco (Technologie Życia)	Numer katalogowy: 10565-018	Kupujemy ten specyficzny preparat zawierający 2,438 g/l wodorowęglanu sodu, 55 mg/l pirogronianu sodu i 4,5 g/l glukozy
Gentamycyna	Thermofisher Naukowy	15710072	Zapas 1000X. Zaleca się przygotowanie i przechowywanie porcji w temperaturze -20 °C, aby uniknąć zamarznięcia/rozmrożenia.
Penicylina/Streptomycyna	Gibco (ThermoFisher Scientific)	Rozdział 15140-122	100X zapas. Zaleca się przygotowanie i przechowywanie porcji w temperaturze -20 °C, aby uniknąć zamarznięcia/rozmrożenia.
Amfoterycyna B	Gibco (ThermoFisher Scientific)	Numer katalogowy: 15290-018	Zapas 500X. Zaleca się przygotowanie i przechowywanie porcji w temperaturze -20 °C, aby uniknąć zamarznięcia/rozmrożenia.
progesteron	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P8783	Roztwór podstawowy o stężeniu 1 mM sporządza się, odpuszczając 15,7 mg proszku progesteronu w 15,7 ml etanolu i dodając 34,3 ml PBS. Roztwór jest sterylnie filtrowany, podawany i przechowywany w temperaturze -20 °C.
17β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Roztwór podstawowy o stężeniu 10 μM sporządza się przez rozpuszczenie 13,5 mg proszku estradiolu w 10 ml etanolu i dodanie 40 ml PBS. Roztwór jest sterylnie filtrowany, podawany i przechowywany w temperaturze -20 °C.
Filtr próżniowy butelkowy (0,22 μm)	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS430769	Do sterylnej filtracji pożywek zbiorczych po przygotowaniu
6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej	BD Sokół	353224	Polistyren, poddany obróbce kultur tkankowych
6-dołkowe transwelle	Milipory	PICM03050	Wkładka - hydrofilowa membrana PTFE o średnicy 30 mm, porach 0,4 μm
Macierz zewnątrzkomórkowa (na przykład Matrigel Matrix)	BD Nauki biologiczne	354234	W naszych badaniach wykorzystaliśmy Matrigel Matrix. W temperaturze pokojowej i w temperaturze -20 °C jest ciałem stałym. Unikaj ponownego zamrażania/rozmrażania. Rozmrozić butelkę do lepkiego roztworu w temperaturze 4 °C i przygotować ~300 μl porcji w chłodni ze schłodzonymi końcówkami pipet. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
Paraformaldehyd, 16% w/v roztwór wodny	Alfa Aesar	30525-89-4	Do utrwalania tkanek przygotowuje się świeży preparat 4% paraformaldehydu przez rozcieńczenie tego wywaru w PBS.
Inkubator do hodowli tkankowych, utrzymywany w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 3 % tlenu (opcjonalnie do hodowli narządów kosmkowych)			W przypadku niektórych eksperymentów preferowane może być niedotlenienie. Można to ustalić na wiele sposobów, w tym dodawanie egzogennego azotu za pomocą butli gazowej, rurki Tygon i regulatora.
Wirówka stołowa

powiedział: