Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Przygotowanie płytek do hodowli organów
UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonywane przy użyciu sterylnej techniki w kapturze do hodowli tkankowej. Idealnie nadaje się, aby mikroskop sekcyjny znajdował się w sterylnym polu. Nie jest to jednak absolutnie konieczne, o ile mikrosekcja jest wykonywana szybko, a narzędzia są często zanurzane w 70% etanolu.
- Rozmrozić fiolkę (fiolki) z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) na lodzie. Rozcieńczyć ECM w stosunku 1:1 lodowatą pożywką do zbierania i wymieszać pipetując. Pipetować powoli, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków. Każda studzienka z 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej wymaga 100 μl tej zawiesiny i pomieści 3-4 kultury narządów.
- Umieścić wkładki transwell (wielkość porów 0,4 μM) w każdym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
- Pokryj każdą wkładkę transwell cienką warstwą (100 μl) zawiesiny ECM/media.
- Umieść płytkę na lodzie i natychmiast przystąp do zakładania kultur narządowych. Alternatywnie, należy przygotować płytkę przed pobraniem tkanki, w którym to przypadku owinąć ją w folię i przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania. Nie zaleca się przechowywania dłuższego niż 6 godzin, ponieważ ECM wyschnie.
2. Zakładanie kultur organowych
UWAGA: Ten krok opisuje, jak umieścić hodowle organów dziesiętnych i hodowle organów kosmków w oddzielnych transwellach. Tkanki nie stykają się ze sobą. Badacze zainteresowani techniką kohodowli, w której decidua i kosmki są ze sobą w bezpośrednim kontakcie, mogą odwołać się do wcześniejszej literatury.
- Wypłukać próbki dwukrotnie w pożywce zbiorczej i odwirować przy 1 000 x g między każdym płukaniem. Przenieś tkankę na sterylną szalkę Petriego i umieść ją na stoliku mikroskopu preparacyjnego. Trzymaj 6-dołkową płytkę na lodzie przylegającym do mikroskopu.
- Mikropreparować tkanki za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych i kleszczy, aby ustalić hodowle narządów kosmkowych 2-3 mm (ryc. 1A).
nuta: Hodowle narządów kosmków to małe, dobrze unaczynione "drzewa" z 2 lub 3 gałęziami i wydatnymi kolumnami komórkowymi trofoblastu (EVT). Ważne jest, aby wykorzystywać tylko tkankę kosmkową z próbek z pierwszego trymestru w <9 tygodniu, ponieważ inwazja trofoblastów poza kosmkami do ECM jest najbardziej wyraźna w tym młodym wieku.
- Wybierz dobrze unaczynione kosmki z wydatnymi kolumnami komórek EVT. Kolumny komórek EVT są wizualizowane jako bulwiaste, "rozmyte", "puszyste" końce (patrz groty strzałek na rysunku 1A).
- Użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść 3 lub 4 kosmyki do każdego transwella. Dostosuj gałęzie tak, aby drzewo było umieszczone płasko na szczycie ECM i oddziel zbite gałęzie.
- Mikropreparować tkankę dziesiętną za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych sprężynowych i kleszczy, aby ustalić hodowle narządów o średnicy 3 mmi 3 dziesiętnych (ryc. 1A).
nuta: Próbki zawierają dwa różne typy tkanek liściastych, decidua parietalis i decidua capsularis (odpowiednio fragmenty lewej i prawej tkanki, ryc. 1A).
- Przytnij nożyczkami, aby utworzyć 3 mm3 kawałki decidua parietalis. Decidua capsularis nie jest stosowany w tych kulturach. Użyj kleszczy, aby usunąć zakrzepłą krew matki.
- Użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść 3-4 kawałki decidua do każdego transwell.
- Dodać 1 ml pożywki zbiorczej na dno studzienki. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
- W przypadku eksperymentów, w których ważne jest naśladowanie normalnego ciśnienia tlenu w łożysku w pierwszym trymestrze ciąży, utrzymuj hodowle narządów kosmków we względnym niedotlenieniu (3%O2).
nuta: Opcje laboratoryjne obejmują małe komory inkubatora hipoksji, które mieszczą się w istniejących inkubatorach lub inkubator trójgazowy, który wprowadza zewnętrzny gazN2 w celu obniżenia stężenia tlenu.
- Dodać 1 ml pożywki kosmkowej lub pożywki dziesiętnej (Tabela 1) do górnej części transwella po 12-16 godzinach hodowli.
nuta: Brak pożywki podczas pierwszej nocy w hodowli pozwala na inwazję zewnętrznych kolumn komórek trofoblastu (hodowla kosmków) i bezpieczne osadzenie tkanki (zarówno kosmków, jak i liści) w ECM. Z naszego doświadczenia wynika, że posiewy narządów dziesiętnych zachowują żywotność przez 72 godziny, a hodowle narządów kosmków przez 96 godzin. Zalecamy eksperymentalne punkty końcowe, które mieszczą się w tym przedziale czasowym. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze składem pożywki kosmkowej i dziesiętnej. Pożywka kosmkowa ma wysoki procent FBS, podczas gdy pożywka dziesiętna jest uzupełniana hormonami ciążowymi (progesteron, 17β-estradiol), które utrzymują stan dziesiętny (Tabela 1).
3. Przygotowanie kultur L. monocytogenes
UWAGA: Szczegółowy protokół dotyczący długoterminowego przechowywania L. monocytogenes, hodowli i wzrostu tego organizmu w bulionie i agarze z naparu do serca (BHI) można znaleźć w Wang et al.
- Wybrać pojedynczą kolonię L. monocytogenes z płytki agarowej BHI i zaszczepić 3 ml bulionu BHI.
- Inkubować kulturę L. monocytogenes przez noc (16 godzin), w pozycji skośnej, w temperaturze 30 °C.
nuta: Takie warunki hodowli pozwalają wzrostowi bakterii osiągnąć fazę stacjonarną. L. monocytogenes jest wiciowiec w temperaturze 30 °C, co zwiększa inwazję komórek gospodarza.
4. Zakażenie kultur narządowych L. monocytogenes
- Ciepły roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) i pożywka kosmkowa lub dziesiętna (tabela 1) do 37 °C.
- Użyj sterylnej pęsety, aby usunąć wszelkie fragmenty hodowli narządów, które nie zaatakowały ECM i dlatego unoszą się w studni.
- Ostrożnie zassać pożywkę z dna transwella. Przepłukać dwukrotnie górne i dolne transwelle, delikatnie pipetując 1 ml ciepłego PBS do studzienki i ostrożnie zasysając pomiędzy nimi. Delikatnie odpipetować 1 ml pożywki kosmkowej lub dziesiętnej bez antybiotyków do górnej i dolnej pożywki transwell. Uważaj, aby nie zakłócić hodowli narządów.
- Pozostaw tkankę do inkubacji w pożywce wolnej od antybiotyków przez co najmniej godzinę, aby upewnić się, że antybiotyki zostały usunięte.
nuta: W fazie stacjonarnej gęstość kultury L. monocytogenes wynosi około 1 x 10,9 jednostek tworzących kolonie (CFU) na ml. Liczba bakterii wykorzystywanych do infekowania kultur narządowych powinna być określona empirycznie, aby sprostać potrzebom doświadczalnym.
- W przypadku L. monocytogenes typu dzikiego rutynowe eksperymenty z infekcją wykazują silną inwazję z rozcieńczeniem 1:50 przez noc (4 x 10,7 L. monocytogenes w 1 ml pożywki na studzienkę). Ponownie zawiesić odpowiednią liczbę bakterii w pożywce kosmkowej lub dziesiętnej bez antybiotyków.
- Zassać pożywkę z górnej części transwelli. Delikatnie dodaj 1 ml inokulum. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 , aby umożliwić inwazję bakterii.
- Usuń bakterie zewnątrzkomórkowe poprzez zasysanie pożywki z górnych i dolnych transwelli. Przepłucz studzienki dwukrotnie ciepłym PBS. Dodać 1 ml pożywki kosmkowej lub dziesiętnej uzupełnionej 50 μg ml-1 gentamycyny. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w 5% CO2,
UWAGA: L. monocytogenes jest fakultatywną bakterią wewnątrzkomórkową, która może rosnąć w podłożu zewnątrzkomórkowym, rosnąć wewnątrz komórek i rozprzestrzeniać się z komórki na komórkę bez dostępu do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Gentamycyna działa bakteriobójczo na zewnątrzkomórkowe L. monocytogenes, a tym samym umożliwia pomiar wewnątrzkomórkowego wzrostu L. monocytogenes i rozprzestrzeniania się w hodowli narządów.
nuta: Powtarzalne zakażenie L. monocytogenes w hodowlach kosmków i narządów decidua następuje po 5 godzinach inkubacji. Czas inkubacji przed dodaniem gentamycyny może być modyfikowany w zależności od potrzeb doświadczalnych i zdolności organizmu do inwazji na tkankę. Aby lepiej zrozumieć miejsca anatomiczne najbardziej podatne na infekcje, można zastosować krótsze czasy inkubacji.
- Utrzymywać płytki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez czas trwania eksperymentu. Codziennie zmieniaj całe media w każdym dołku.
nuta: Z naszego doświadczenia wynika, że posiewy narządów dziesiętnych zakażone L. monocytogenes zachowują żywotność przez 48 godzin, a hodowle narządów kosmków przez 72 godziny.
Tabela 1: Przepisy medialne. Składniki i stężenia do przygotowania buforu do przemywania (Wash buff), Pożywki zbiorczej, Pożywki kosmkowej i Pożywki dziesiętnej
| Bufor do płukania | Nośnik kolekcji | Podłoże kosmkowe | Pożywka dziesiętna |
| Pbs | DMEM/F-12 z GlutaMAX | DMEM/F-12 z GlutaMAX | DMEM/F-12 z GlutaMAX |
| Penicylina 100 j.m./ml | Surowica bydlęca płodu 2,5% | Surowica bydlęca płodu 20% | Surowica bydlęca płodu 2,5% |
| Streptomycyna 100 μg/ml | Penicylina 100 j.m./ml | Penicylina 100 j.m./ml | 17β-estradiol 300 pg/ml |
| Gentamycyna 50 μg/ml | Streptomycyna 100 μg/ml | Streptomycyna 100 μg/ml | Progesteron 20 ng/ml |
| Amfoterycyna B 1,25 μg/ml | Gentamycyna 50 μg/ml | | |
| Amfoterycyna B 1,25 μg/ml | | |
