1. Inokulacja w sprayu z zawiesiną M. grisea Conidia
- Kultura grzybów dla M.grisea
- Przygotuj pożywkę do hodowli pomidorów owsianych (OTA) dla szczepów grzybów.
- Zważ 30 - 50 g płatków owsianych, dodaj je do 800 ml wody destylowanej/dejonizowanej (ddH2O) i gotuj mieszaninę przez 30 minut w garnku elektrycznym.
- Przefiltruj ugotowany sok owsiany do zlewki przez kawałek gazy.
- Dodać 150 ml soku pomidorowego i 20 g agaru do filtratu w zlewce i dodać ddH2O do 1 000 ml.
- Przygotowanie materiałów doświadczalnych
- Namocz około 50 nasion ryżu (Oryza sativa) odmiany Lijiangxintuan-heigu (LTH) w ddH2O przez 3 dni lub namocz około 50 nasion jęczmienia (Hordeum vulgare cv Golden Promise) w ddH2O przez około 1 d.
- Zawinąć nasiona ryżu lub jęczmienia w wilgotną gazę i wykiełkować je na wilgotnej bibule filtracyjnej na około 30 szalkach Petriego o średnicy 10 cm x 10 cm w temperaturze 28 °C. Czas kiełkowania nasion ryżu wynosi około 2 - 3 dni, a czas kiełkowania nasion jęczmienia wynosi około 2 dni. Wilgotność względna w szklarni wynosi około 70%.
- Posadź sadzonki ryżu lub jęczmienia w doniczkach, używając autoklawowanej ziemi doniczkowej i podlewania, a następnie przykryj je warstwą wermikulitu.
- Umieść rośliny w odpowiedniej szklarni lub komorze wzrostowej w temperaturze 25 °C na około 1 ~ 2 tygodnie.
- Wytnij 3 warstwy bibuły filtracyjnej w kółkach sterylnymi nożyczkami chirurgicznymi (każde kółko powinno mieć średnicę 8 cm) i umieść je na sterylnych plastikowych płytkach o średnicy 100 mm.
- Dodaj ddH2O do każdego naczynia, aby namoczyć bibułę filtracyjną.
- Upewnij się, że bibuła filtracyjna jest całkowicie mokra, ale nie dodawaj dodatkowej wody.
- Usuń nadmiar wody za pomocą pompy próżniowej.
- Umieść 2 sterylne wykałaczki w naczyniu hodowlanym, aby podeprzeć liście ryżu/jęczmienia; rozmieść wykałaczki w odległości ~2 - 3 cm od siebie.
- Zbierz liście ryżu 2 tygodnie po wysianiu nasion lub weź liście jęczmienia 7 dni po wysianiu nasion.
- Używając 4- do 6-listnych sadzonek ryżu/jęczmienia, odetnij dolną część łodygi w odległości ~5 cm od góry i zbierz liście.
- Protokół inokulacji w sprayu
- Hodowla szczepu grzyba na płytkach OTA w inkubatorze termostatycznym (25 °C) przez ~4 dni.
- Dodaj ~2 ml ddH2O za pomocą pipety 0,5 - 5 ml do każdej 4-dniowej płytki.
- Za pomocą pętli inokulacyjnej zeskrob grzybnię szczepu M. grisea typu dzikiego i zmutowany szczep do szczątków grzybni.
- Zbierz resztki grzybni i przenieś je na nową płytkę tubą optyczną. Weź resztki grzybni i wysusz je suszarką na czystej ławce.
- Przykryj płytkę 3 warstwami gazy, aby zapewnić wilgotność wymaganą do wzrostu konidiów w szklarni w temperaturze 25 °C w ciągu dnia (14 godzin) i 23 °C w nocy (10 godzin) przez 24 - 48 godzin.
- Dodaj 2 ml ddH2O do każdego naczynia i delikatnie zeskrob konidia sterylnymi bawełnianymi wacikami, a następnie przefiltruj przez 2 warstwy bibuły do soczewek. Uważaj, aby nie zarysować powierzchni pożywki hodowlanej.
- Przenieść zawiesinę konidiów do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety o pojemności 100 - 1 000 μl.
- Wirować przez 5 minut przy minimalnej sprężystości 5 000 x g w temperaturze 25 °C.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad, aby uzyskać 2 x 104 konidiów na ml w 0,025% (v/v) roztworze Tween-20. Roztwór Tween-20 ma zwykle około 10 - 20 ml.
- Wlej zawiesinę zarodników do ręcznego opryskiwacza.
- Spryskać około 10 ml zawiesiny konidialnej na liście ryżowe 2-tygodniowych siewek ryżu lub liście jęczmienia 7-dniowych sadzonek jęczmienia i inkubować je w temperaturze 25 °C w ciemnej, wilgotnej komorze przez ~24 godziny. Spryskać rośliny kontrolne 0,025% (v/v) roztworem Tween-20.
- Przenieść liście do innej wilgotnej komory pod wpływem światła fluorescencyjnego w temperaturze 25 °C przez 12 godzin fotoperiodu.
- Objawy choroby należy zapisać po 5 dniach od inokulacji. Zbadaj chore źdźbła ryżu/jęczmienia o długości ~6 cm. Standard oceny jest zgodny z systemem punktacji za odporność na wybuchy Międzynarodowego Instytutu Badań nad Ryżem (IRRI). Szczegółowe informacje na temat systemu punktacji w zakresie odporności na wybuch przedstawiono w tabeli 1.
- Sfotografuj liście, aby ocenić infekcję badanych szczepów. Zakażenie oceniano na podstawie liczby zmian na 3,6cm2.
Tabela 1: System punktacji dla odporności na wybuchy. Tabela jest cytowana przez Międzynarodowy Instytut Badań nad Ryżem (IRRI).
| skala | opis |
| 1 | Małe brązowe plamki o szpiczastym rozmiarze |
| cyfra arabska | Małe okrągłe do lekko wydłużonych, nekrotyczne szare plamki o średnicy około 1-2 mm, z wyraźnym brązowym brzegiem. Zmiany chorobowe znajdują się głównie na górnych liściach |
| 3 | Rodzaj zmiany jest taki sam jak w 2, ale znaczna liczba zmian znajduje się na górnych liściach |
| 4 | Typowe wrażliwe zmiany powietrzne, 3 mm lub dłuższe, infekujące mniej niż 4% powierzchni liści |
| 5 | Typowe wrażliwe zmiany powietrzne, 3 mm lub dłuższe, infekujące mniej niż 4-10% powierzchni liści |
| 6 | Typowe wrażliwe zmiany powietrzne, 3 mm lub dłuższe, infekujące mniej niż 11-25% powierzchni liści |
| 7 | Typowe wrażliwe zmiany powietrzne, 3 mm lub dłuższe, infekujące mniej niż 26-50% powierzchni liści |
| 8 | Typowe podatne zmiany powietrzne, 3 mm lub dłuższe, infekujące mniej niż 51-75% powierzchni liści, wiele liści martwych |
| 9 | Typowe wrażliwe zmiany powietrzne, o średnicy 3 mm lub większej, infekują ponad 75% powierzchni liści |
