Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Kolekcja serum
- Zbieraj próbki surowicy od ludzi w interesujących punktach czasowych. W tym badaniu pobraliśmy surowice w dniach 0 (czas szczepienia przeciwko grypie), +7, +30, +60 i +180 po szczepieniu.
- Aby otrzymać surowicę, odwirować probówki z próbkami o sile 1 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (20 - 25 °C).
nuta: Nieodwirowane próbki krwi powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C i nie dłużej niż 24 godziny.
- Podzielić surowicę na różne probówki (kriofiolki) i zamrażać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
- Wykonuj kolejne testy pod względem partii, uwzględniając wszystkie punkty czasowe jednej osoby, aby zmniejszyć zmienność w obrębie pacjenta.
2. Przygotowanie antygenów
UWAGA: Używanych jest pięć różnych antygenów (patrz Spis materiałów). Przygotowanie antygenów w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).
- Zgodnie z instrukcjami producenta, przed przystąpieniem do kontynuowania należy rozpuścić całkowitą zawartość jednej liofilizowanej ampułki z antygenem grypy w 1,0 ml wody destylowanej i pozostawić rozpuszczony antygen na co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Roztwór antygenu rozprowadzić do probówek o pojemności 1,5 ml i zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
3. Przygotowanie filtratu
UWAGA: Filtrat jest używany jako enzym niszczący receptory (RDE) zgodnie z protokołem Światowej Organizacji Zdrowia (WHO). Powoduje to usunięcie z surowicy wrodzonych inhibitorów, które mogłyby zakłócać test.
- Rozpuścić liofilizowany RDE zgodnie z instrukcjami producenta.
- Roztwór RDE należy przechowywać w probówce o pojemności 15 ml w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
4. Test HA
UWAGA: Aby zapewnić, że testy hamowania hemaglutynacji (HI) są porównywalne między kilkoma płytkami, ta sama ilość cząsteczek wirusa musi być użyta dla każdej płytki. Test hemaglutynacji (HA) (zwany również miareczkowaniem HA) jest wykonywany w celu ilościowego określenia cząstek wirusa niezbędnych do hemaglutynacji i jest rejestrowany w jednostkach HA. "Jednostka" hemaglutynacji jest jednostką operacyjną zależną od metody zastosowanej do miareczkowania kwasu hialuronowego i nie jest miarą bezwzględnej ilości wirusa. Zatem jednostka HA jest definiowana jako ilość wirusa potrzebna do aglutynacji równej objętości standaryzowanej zawiesiny RBC. Według WHO standardowa ilość stosowana do testu HI wynosi 4 jednostki HA na 25 μL. Aby zilustrować zasadę oznaczania kwasu hialuronowego, patrz rysunek 1.
UWAGA: Użyte czerwone krwinki (RBC) są zależne od typu wirusa grypy w teście (Tabela 1). Ponadto, dla różnych typów 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych, czas inkubacji, jak również wygląd nieaglutynowanych komórek różnią się (Tabela 2).
- Przygotowanie zawiesiny RBC
- Rozcieńczyć zawiesinę podstawowych krwinek czerwonych (10%, v/v; z wyjątkiem grupy ludzkiej O) (patrz tabela materiałów) solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu uzyskania odpowiednich stężeń erytrocytów u ptaków i ssaków, wynoszących odpowiednio 0,75% i 1%.
- Przygotowanie 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania
UWAGA: Patrz Rysunek 2, aby zapoznać się z ponadview konstrukcji płyty.
- Dodać 25 μl PBS do dołków od 1 do 12 z każdego używanego rzędu 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania za pomocą pipety wielokanałowej (Rysunek 2). Płytki do mikromiareczkowania w kształcie litery V należy używać podczas pracy z krwinkami czerwonymi ptaków, takimi jak kurczak i indyk. Płytki do mikromiareczkowania w kształcie litery U należy używać podczas pracy z krwinkami czerwonymi ssaków, takich jak świnki morskie i ludzie typu O (Tabela 2).
- Dodać 25 μl antygenu grypy do pierwszego dołka z rzędów antygenu, które są ułożone w dwóch egzemplarzach. Do wierszy kontrolnych nie jest dodawany żaden antygen. Rzędy kontrolne nie powinny wykazywać efektu hemaglutynacji i służyć jako kontrole ujemne (ryc. 2).
- Przeprowadzić seryjne 2-krotne rozcieńczenie, przenosząc 25 μl z pierwszego dołka rzędu antygenu do kolejnych dołków za pomocą pipety wielokanałowej. Wymieszaj każdy etap rozcieńczenia, delikatnie pipetując w górę i w dół 10 razy.
- Wyrzuć ostatnie 25 μl z ostatnich studzienek.
- Dodać 25 μl PBS do studzienek od 1 do 12 z każdego używanego rzędu za pomocą pipety wielokanałowej, aby osiągnąć całkowitą objętość 50 μl na studzienkę.
- Dodać 50 μl zawiesiny RBC do każdej używanej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej.
- Ostrożnie postukaj w talerz 10 razy ze wszystkich czterech stron, aby wymieszać.
- Przykryć płytkę pokrywką i inkubować w temperaturze pokojowej przez odpowiedni okres czasu, w zależności od użytych gatunków erytrocytów (patrz tabela 2). Nie przesuwaj płytki podczas inkubacji.
- Odczyt tabliczki
UWAGA: Odczyt jest nieco inny w przypadku stosowania erytrocytów ptaków w porównaniu z erytrocytami ssaków, ze względu na inny kształt studzienek mikromiareczkowych (ryc. 3).
- Odczyt krwinek czerwonych ptaków
- Przechyl płytkę o 90° przez 25 s.
nuta: Punkt końcowy miareczkowania kwasu hialuronowego jest ostatnim dołkiem, w którym zachodzi całkowita hemaglutynacja. Ta studzienka zawiera 1 jednostkę HA wirusa. Ze względu na 2-krotne rozcieńczenie antygenu, dwie studzienki przed punktem końcowym miareczkowania HA to studzienka, która zawiera 4 jednostki HA wirusa (ryc. 4).
- Natychmiast oznacz wyniki, gdy płytka jest jeszcze w pozycji pochylonej, na wydrukowanym schemacie płytki 96-dołkowej. Schematy aglutynacji krwinek czerwonych ptaków przedstawiono na rysunku 3.
- Odczyt krwinek czerwonych ssaków
- Zaznaczyć wyniki na wydrukowanym schemacie płytki 96-dołkowej, bez przechylania płytki (pozycja pozioma na ławce).
nuta: Kiedy dochodzi do hemaglutynacji, aglutynowane komórki nie osiadają na dnie, podczas gdy komórki nieaglutynowane pojawiają się jako aureola na dnie studzienki. Halo częściowo aglutynowanych komórek jest mniej intensywne i ma większą średnicę (ryc. 3).
- Oznaczanie 4 jednostek HA.
nuta: Przechylanie płytki ma kluczowe znaczenie dla różnicowania wzorów ptasich, ponieważ wszystkie trzy różne typy wzorów aglutynacji (całkowicie aglutynowane, częściowo aglutynowane i nieaglutynowane) pojawiają się jako przycisk, gdy nie są przechylone.
5. Test HI
UWAGA: Przepływ pracy protokołu został zoptymalizowany, aby umożliwić bardziej efektywną obsługę wielu próbek w tym samym czasie, przy użyciu pasków probówek do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i termocyklera (patrz poniżej).
- Przygotowanie próbek surowicy
nuta: Przygotować próbki surowicy w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).
- Rozmrozić zamrożone próbki surowicy z każdego punktu czasowego każdej osoby (patrz krok 1.2) w temperaturze pokojowej.
- Dodać podwielokrotność 10 μl każdej rozmrożonej próbki surowicy do probówki z paskiem probówki do PCR (10 probówek w jednym pasku).
nuta: Dużą zaletą stosowania pasków probówek do PCR jest to, że pipeta wielokanałowa może być używana do następujących etapów testu HI; Pozwala to zaoszczędzić dużo czasu podczas badania dużej liczby próbek surowicy oraz podczas wykonywania powtarzających się pomiarów tych samych próbek pod kątem miana przeciwciał przeciwko różnym szczepom wirusa.
- Przechowywać podane próbki surowicy w paskach probówki do PCR w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
- Na dzień przed wykonaniem testu HI należy rozmrozić badaną próbkę surowicy w temperaturze pokojowej.
- Dodać 10 μl odpowiedniej surowicy do pustej probówki PCR.
nuta: Aby służyć jako kontrola pozytywna, surowica przeciwko określonemu wirusowi musi być zgodna z zastosowanym wirusem. Kontrola pozytywna pozwala na standaryzację wydajności płyt na wielu płytach.
- Dodać 30 μl roztworu filtratu do każdej podwielokrotności surowicy i do surowicy odpornościowej (3 objętości przesączu na 1 objętość surowicy) za pomocą pipety wielokanałowej.
- Trzymaj probówki do PCR w 96-dołkowym stojaku do PCR lub w pustym pudełku na końcówki i wiruj przez 5 sekund.
- Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze 37 °C za pomocą termocyklera.
- Inkubować próbki w temperaturze 56 °C przez 30 minut w celu dezaktywacji filtratu za pomocą termocyklera.
nuta: W zależności od termocyklera, krok ten można zaprogramować, aby jeszcze bardziej zautomatyzować proces.
- Trzymaj probówki do PCR w 96-dołkowym stojaku do PCR lub w pustym pudełku na końcówki i wiruj przez 5 sekund.
- Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w lodówce do czasu wykorzystania ich do testu HI.
- Test HI
nuta: Aby zilustrować zasadę testu HI, patrz rysunek 1. W zależności od wirusa do testu wykorzystuje się różne gatunki erytrocytów (tabela 1). Różne gatunki erytrocytów są stosowane w różnych typach płytek 96-dołkowych, a czas inkubacji, a także wygląd komórek nieaglutynowanych są różne (tabela 2). W przypadku testu HI do serii 2-krotnego rozcieńczenia próbek dodaje się 4 jednostki HA wirusa lub antygenu.
- Przygotowanie roztworu antygenu
- Obliczyć potrzebną objętość roztworu antygenu w zależności od liczby użytych płytek 96-dołkowych (25 μl antygenu na dołek × 96 = 2 400 μl antygenu na płytkę 96-dołkową; dodać 100 μl na płytkę dodatkowo ze względu na użycie zbiornika na pipetę wielokanałową; łącznie 2,5 ml antygenu na płytkę).
nuta: Na przykład, jeśli mierzy się 100 próbek surowicy, potrzeba 10 płytek (10 próbek na płytkę): 2,5 ml x 10 = łącznie 25 ml roztworu antygenu.
- Przygotować odpowiednie rozcieńczenie 4 jednostek kwasu hialuronowego dla obliczonej objętości za pomocą PBS.
UWAGA: Do testu HA określa się 4 jednostki HA. Aby uzyskać odpowiednią ilość antygenu, należy podzielić obliczoną objętość przez miano odpowiadające 4 jednostkom HA. Na przykład 4 jednostki HA odpowiadają rozcieńczeniu 1/64, a my potrzebowaliśmy 15 000 μl roztworu antygenu: dodaje się 15 000/64 = 234,4 μl rozpuszczonego liofilizowanego antygenu grypy.
- Przygotowanie zawiesiny RBC
- Obliczyć potrzebną objętość zawiesiny RBC w zależności od liczby użytych 96-dołkowych płytek do mikromiareczkowania (50 μl zawiesiny RBC na dołek × 96 = 4 800 μl zawiesiny RBC na płytkę 96-dołkową; dodać 200 μl na płytkę dodatkowo ze względu na użycie zbiornika na pipetę wielokanałową).
- Rozcieńczyć zawiesinę krwinek czerwonych (zwykle 10%, v/v; z wyjątkiem grupy ludzkiej O) PBS, aby uzyskać odpowiednie stężenia erytrocytów czerwonych u ptaków i ssaków, wynoszące odpowiednio 0,75% i 1%.
- Przygotowanie 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania
- Oznaczyć 96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania (identyfikator próbki, kontrola pozytywna i miareczkowanie wsteczne). Proszę dokładnie sprawdzić orientację płyty na rysunku 5.
- Dodać 25 μl PBS do każdego dołka z wyjątkiem pierwszego dołka w rzędzie "miareczkowania wstecznego" (Rysunek 5, 12rząd za pomocą pipety wielokanałowej.
nuta: Przeprowadzono miareczkowanie wsteczne w celu sprawdzenia, czy użyte rozcieńczenie antygenu jest równe 4 jednostkom HA. Miano antygenu wynoszące 4 jednostki HA jest wskazane, jeśli hemaglutynacja występuje w pierwszych trzech dołkach rzędu "tylnego miareczkowania", ale nie w czwartej studzience.
- Dodać 50 μl przygotowanego roztworu antygenu (opisanego w ppkt 5.2.1) do pierwszego dołka w rzędzie "tylnego miareczkowania" (12. rząd).
- Dodać 25 μl próbek surowicy poddanych działaniu RDE do pierwszych dołków w rzędach od 1 do 10 na każdej płytce, używając pipety wielokanałowej.
- Dodać 25 μl odpowiedniej surowicy do pierwszego dołka w 11rzędzie jako kontrolę dodatnią.
- Wykonać seryjne 2-krotne rozcieńczenia, przenosząc 25 μl z pierwszego dołka każdego rzędu (1 - 12) do kolejnych dołków za pomocą pipety wielokanałowej. Mieszać, pipetując w górę i w dół 10 - 15 razy na każdy etap rozcieńczania. Te same końcówki mogą być używane dla każdego etapu rozcieńczania na próbkę.
- Wyrzuć ostatnie 25 μl z ostatnich studzienek.
- Dodać 25 μl roztworu antygenu za pomocą pipety wielokanałowej do każdego dołka w rzędach od 1 do 11 (próbki surowicy i surowica). Te same końcówki można użyć, jeśli nie dotykają studni.
- Dodać 25 μl PBS zamiast antygenu do każdego dołka w rzędzie "tylnego miareczkowania" (12. rząd).
- Ostrożnie postukaj w talerz 10 razy ze wszystkich czterech stron, aby wymieszać.
- Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Nie przesuwaj płytki podczas inkubacji.
- Dodać 50 μl zawiesiny RBC do każdego dołka.
- Ostrożnie postukaj w talerz 10 razy ze wszystkich 4 stron, aby wymieszać.
- Przykryć płytkę pokrywką i inkubować w temperaturze pokojowej przez odpowiedni okres czasu, w zależności od użytych gatunków erytrocytów (patrz tabela 2). Nie przesuwaj płytki podczas inkubacji.
- Odczyt tabliczki
nuta: Miano HI jest odwrotnością ostatniego rozcieńczenia surowicy (anty-), która całkowicie hamuje hemaglutynację. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że surowice poddane działaniu RDE były już rozcieńczone w stosunku 1:4, a po etapie seryjnego rozcieńczania surowice w pierwszych studzienkach rozcieńcza się w stosunku 1:8, co odpowiada mianu HI wynoszącemu 8.
- Odczyt krwinek czerwonych ptaków
- Przechyl płytę o 90° przez 25 s.
nuta: Przechylanie płytki ma kluczowe znaczenie dla różnicowania wzorów ptasich, ponieważ wszystkie trzy różne typy wzorów aglutynacji (całkowicie aglutynowane, częściowo aglutynowane i nieaglutynowane) pojawiają się jako przycisk, gdy nie są przechylone.
- Natychmiast oznacz wyniki, gdy płytka jest jeszcze w pozycji pochylonej, na wydrukowanym schemacie płytki 96-dołkowej. Schematy aglutynacji ptasich krwinek czerwonych przedstawiono na rysunku 3.
Tabela 1: Antygeny grypy i odpowiadające im gatunki erytrocytów. Zgodnie z instrukcjami producenta (NIBSC).
| Antygen grypy | A/Kalifornia/7/09 (H1N1) | A/Szwajcaria/9715293/2013 (H3N2) | A/Teksas/50/2012 (H3N2) | B/Brisbane/60/08 | B/Massachusetts/02/2012 |
| Gatunki RBC | kurczak | świnka morska | świnka morska | Turcja | Turcja |
Tabela 2: Warunki oznaczania różnych gatunków krwinek czerwonych.Zgodnie z protokołem WHO. (* płynie po przechyleniu).
.
.
| Gatunki RBC | kurczak | Turcja | świnka morska | Typ ludzki O |
| Stężenie krwinek czerwonych (v/v) | 0,75% | 0,75% | 1 proc | 1 proc |
| Rodzaj płytki do mikromiareczkowania | V dół | V dół | U dół | U dół |
| Czas inkubacji, RT | Czas trwania: 30 min | Czas trwania: 30 min | 1 godzina | 1 godzina |
| Pojawienie się komórek nieaglutynowanych | guzik* | guzik* | aureola | aureola |
