Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Izolacja i różnicowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMM)
- Dzień 0: Złożenie w ofierze 4 - 6-tygodniowej samicy myszy C57BL/6 lub BALB/c w komorze CO2 i potwierdzenie zgonu w wyniku zwichnięcia szyjki macicy. Zapewnij sterylizację nożyczek i kleszczy, trzymając je namoczone w 70% etanolu. Spryskaj rękawice 70% etanolem, aby umożliwić sterylną obsługę podczas całego procesu izolacji komórek szpiku kostnego.
- Przymocuj ofiarowaną mysz do deski preparcyjnej, przypinając jej przednie kończyny i dezynfekując ją, obficie spryskując 70% etanolem.
- Wykonaj małe nacięcie (około 1 cm) nożyczkami w pobliżu stawu biodrowego. Ostrożnie włóż nożyczki pod skórę, aby oddzielić mięsień znajdujący się pod spodem i przeciąć skórę wokół stawu biodrowego.
nuta: Deska sekcyjna może być obracana, aby umożliwić lepszy dostęp do stawu biodrowego.
- Ostrożnie odczep skórę od nogi, ciągnąc w kierunku kostki i usuwając ją. Odetnij stopę w kostce, bardzo ostrożnie, aby przeciąć na lub poniżej stawu skokowego, aby pozostawić piszczel w pełni nienaruszoną.
nuta: Kość strzałkowa na tym etapie jest luźno przymocowana i można ją łatwo oddzielić za pomocą kleszczy.
- Ręcznie zlokalizuj staw biodrowy, manipulując kością udową, aby określić punkt obrotu. Ostrożnie użyj nożyczek, aby odciąć nogę powyżej stawu biodrowego, aby pozostawić nienaruszoną bliższą głowę kości udowej.
- Usuń jak najwięcej mięśni i tkanki łącznej z nogi za pomocą nożyczek. Usuń pozostałą skórę z kostki i nadmiar materiału kostnego powyżej stawu biodrowego.
- Oczyszczone kości nóg umieścić w sterylnym Roswell Park Memorial Institute RPMI z dodatkiem penicyliny/streptomycyny (1% stężenia końcowego) na szalce Petriego na lodzie.
- Powtórz kroki od 1.4 do 1.6, aby odizolować kość piszczelową i kość udową od drugiej tylnej nogi.
- Usuń wszelkie pozostałe mięśnie i tkankę łączną z kości moczących się w RPMI za pomocą wysterylizowanych kleszczy i sterylnego ostrza #10.
- Umieść kości na pokrywie szalki Petriego. Ostrożnie przetnij kość piszczelową ostrzem bezpośrednio nad stawem skokowym, aby uzyskać dostęp do szpiku. Usuń kość piszczelową z reszty nogi, przecinając ją bezpośrednio pod stawem kolanowym.
- Pobrać 10 ml sterylnego RPMI uzupełnionego penicyliną/streptomycyną (1% stężenia końcowego) do strzykawki o pojemności 10 ml i przymocować igłę 25G.
- Trzymaj kość piszczelową mocno kleszczami, pionowo nad stożkową rurką o pojemności 50 ml na lodzie. Za pomocą strzykawki delikatnie wstrzyknąć około 5 ml RPMI w koniec kości, aby wypłukać szpik kostny z drugiego końca do stożkowej rurki. Przepłucz szpik kostny łącznie 10 ml RPMI, aż kość stanie się biała.
nuta: Po dokładnym spłukaniu kość powinna zmienić kolor na biały. Jeśli nie, kontynuuj płukanie, aby usunąć szpik. Dystalny koniec kości piszczelowej może wymagać przycięcia ostrza, jeśli jest zbyt wąski, aby wprowadzić igłę.
- Przeciąć kość udową bezpośrednio nad stawem kolanowym i bezpośrednio poniżej stawu biodrowego, aby odsłonić oba końce kości w celu uzyskania dostępu do szpiku. Przepłucz szpik kostny z kości udowej łącznie 10 ml RPMI w taki sam sposób jak kość piszczelowa.
- Powtórzyć kroki czyszczenia i płukania od 1,6 do 1,13 z pozostałymi kośćmi i zebrać przepłukane komórki szpiku kostnego w pojedynczej stożkowej probówce o pojemności 50 ml
nuta: Jeśli kość pęknie w dowolnym momencie podczas sekcji przed zaczerwienieniem kości, nie należy używać szpiku z tej kości.
- Odwirować stożkową probówkę używaną do zbierania szpiku kostnego wypłukanego ze wszystkich czterech kości przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy 300 x g.
- Umieścić 60 ml sterylnej pożywki BMM (RPMI o końcowym stężeniu 20% płodowej surowicy bydlęcej, FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 1,2 mM pirogronianu Na, 25 μg/ml ludzkiego czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) w kolbie do hodowli komórkowych o długości 175 cmz nasadką filtrującą.
- Po odwirowaniu odrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić osad komórkowy poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół, używając 5 ml pożywki BMM z kolby.
- Przenieść zawiesinę komórek do kolby hodowlanej i dwukrotnie przepłukać stożkową probówkę pożywką BMM z kolby hodowlanej, aby zapewnić maksymalny odzysk komórek. Upewnij się, że zawiesina komórkowa jest dokładnie wymieszana z pożywką i rozprowadzić 30 ml z początkowej kolby do hodowli komórkowych o długości 175 cm2 do drugiej kolbydo hodowli komórkowych o długości 175 cm z nasadką filtrującą.
- Inkubować obie kolby zawierające 30 ml zawiesiny komórek każda przez noc w temperaturze 37 °C, 5% dwutlenku węgla (CO2 ), aby umożliwić oddzielenie wszelkich zanieczyszczających fibroblastów, rezydujących makrofagów i innych przylegających komórek.
- DZIEŃ 1: Przenieść supernatant zawierający niezróżnicowane komórki szpiku kostnego z kolb na polistyrenowe płytki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm niepoddanych działaniu TC w ilości około 10 ml na szalkę i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .Wyrzucić kolby.
- DZIEŃ 3 lub 4: Dodać dodatkowe 5 ml pożywki BMM (wstępnie podgrzanej do 37 °C) do każdej płytki Petriego i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
2. Poszycie BMM na szkiełkach nakrywkowych w przypadku infekcji (DZIEŃ 7 lub 8)
- Przygotować 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych, umieszczając cztery (4) sterylne szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 12 mm (autoklawowane i przechowywane w zamkniętym szklanym pojemniku) na dnie każdej pustej studzienki.
nuta: Podnieś każde sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm za pomocą zasysającej końcówki zamontowanej na przewodzie próżniowym. Umieść szkiełka nakrywkowe w studzienkach bez zachodzenia na siebie, zwalniając je w żądanej pozycji, ściskając rurkę, aby przerwać próżnię.
- Odessać pożywkę (i wszelkie nieprzylegające komórki) z szalek Petriego pokrytych przylegającymi makrofagami pochodzącymi ze szpiku kostnego i delikatnie przepłukać przylegające komórki 2x sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem Dulbecco bez chlorku wapnia i magnezu (PBS -/-) wstępnie podgrzanym do 37 °C.
- Dodawać kroplami, 5 ml sterylnego 1x PBS -/- o końcowym stężeniu 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do każdej szalki Petriego i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu odłączenia przylegających BMM. Sprawdzić, czy komórki są odłączone za pomocą mikroskopu.
- Zbierz wszystkie odłączone komórki zawieszone w 1x PBS -/- uzupełnione 1 mM EDTA w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Opłucz każde naczynie 2x 5 ml PBS -/- i dodaj do puli zawiesiny komórek.
nuta: Zawiesinę komórkową można rozcieńczyć dodatkowym PBS -/- w celu ochrony makrofagów przed toksycznością EDTA podczas procesu pobierania.
- Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić makrofagi w pożywce o objętości 5 - 10 ml BMM przez pipetowanie. Umieść zawieszone komórki na lodzie, aby zapobiec przyczepianiu się do rurek i zbrylaniu.
- Policz żywe komórki, korzystając z wykluczenia błękitu trypanowego w hemocytometrze.
nuta: Aby policzyć komórki BMM zawieszone w pożywce o pojemności 5 ml, mieszanina rozcieńczeń 25 μl zawiesiny komórek w 445 μl PBS -/- i 30 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego zwykle umożliwia łatwe określenie ilościowe w hemocytometrze (biorąc pod uwagę 20-krotny współczynnik rozcieńczenia do końcowych obliczeń). Policz tylko komórki, które nie zostały wybarwione błękitem trypanowym (komórki żywotne). Objętość zawiesiny komórek może ulec zmianie, jeśli mieszanina ta jest zbyt stężona lub rozcieńczona. Ogólnie rzecz biorąc, wydajność BMM na preparat waha się od 2 x 107 do 5 x 107 komórek z jednej myszy.
- Przygotować zawiesinę komórek w pożywce BMM o pożądanym stężeniu galwanicznym (5 x 105/ml) i zdyspergować zawiesinę na 6 płytkach dołkowych w pożywce po 2 ml na studzienkę, tak aby każda studzienka otrzymała 1 x 106 makrofagów.
nuta: Jest to krytyczny krok, który zapewnia, że każda studzienka otrzymuje odpowiednią liczbę makrofagów, aby równomiernie pokryć szkiełka nakrywkowe. Sprawdź, czy szkiełka nakrywkowe w studzienkach nie zachodzą na siebie ani nie unoszą się w podłożu. Jeśli tak, delikatnie wyreguluj za pomocą sterylnej końcówki do pipety.
- Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
3. Oczyszczanie zakaźnych form Leishmania amazonensis
UWAGA: Przygotuj Leishmania na infekcje - oczyść metacykliczne promastigoty ze stacjonarnych kultur promastynów, lub zróżnicuj promastigoty w kulturze do formy amastigotycznej, używając standardowego protokołu różnicowania aksonicznego L. amazonensis.
- Oczyszczanie metacyklicznych promastigotów Leishmania za pomocą ośrodków o gradiencie gęstości (Materiały)
- Przygotować 40% roztwór podstawowy pożywek o gradiencie gęstości w sterylnej wodzie wolnej od endotoksyn.
- Rozcieńczyć roztwór gradientu gęstości w 10x pożywce M199 (bez surowicy), aby przygotować 10% stężenie w pożywce M199.
- Przefiltruj wszystkie roztwory przez filtr 0,22 μm.
nuta: Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze 4 oC w ciemności nie dłużej niż 1 miesiąc.
- Dodaj 2 ml roztworu pożywki o gradientzie gęstości 40% na dno stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
- Warstwę 2 ml roztworu pożywki gradientowej o gęstości 10% w M199 ostrożnie nałożyć na warstwę podłoża o gradiencie o gęstości 40%, używając pipety Pasteura, aby uniknąć mieszania się między dwiema warstwami.
- Zebrać 1 x 109 pasożytów z hodowli w fazie stacjonarnej przez odwirowanie przy 1 900 x g przez 10 minut.
- Zawieś komórki w 6 ml zmodyfikowanej pożywki niezbędnej (DMEM) firmy Dulbecco.
- Warstwę 2 ml zawiesiny komórek bezpośrednio na warstwę pożywki o gradiencie gęstości 10%, delikatnie, używając pipety Pasteura, aby uniknąć mieszania między warstwami.
- Odwirowywać gradient przez 10 minut przy 1 300 x g w temperaturze pokojowej.
nuta: Ze względu na różnice we właściwościach fizycznych między gatunkami Leishmania, warunki wirowania dla każdego z nich mogą wymagać nieznacznego dostosowania, aby zapewnić maksymalną wydajność.
- Zbierz pasożyty (wzbogacone w metacykliczną formę promastygoty) z pasma utworzonego na górnej granicy ośrodków gradientu gęstości 10% (interfejs między warstwami ośrodków gradientu gęstości 0% i 10%).
- Rozcieńczyć pasożyty jedną objętością DMEM i zebrać przez odwirowanie (1 900 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej).
- Ponownie zawiesić w pożywce DMEM o pojemności 500 μl i policzyć w hemocytometrze, aby określić ilościowo wydajność.
- Wytwarzanie L. amazonensis amastigotes w warunkach hodowli aksonicznej (niskie pH / podwyższona temperatura)
- Zmieszać 5 ml kultury promastigoty w fazie logarytmicznej (pH 7,4 w temperaturze 26 °C) z równą objętością pożywki amastigoty (pH 4,5), używając kolb o długości 25 cm2 (łącznie 10 ml pożywki) i inkubować przez noc w temperaturze 26 °C.
- Przesunąć kolbę z 26 °C do 32 °C.
- Po 3 lub 4 dniach rozdzielić kulturę 1:5 w pożywce amastigote w temperaturze 32 °C.
- Sprawdź pasożyty w ciągu najbliższych 3 - 4 dni (maksymalnie 7 dni), aby zobaczyć, czy są gotowe do użycia w infekcjach.
nuta: Zdrowe amastigoty akseniczne powinny mieć owalny kształt, bez widocznych wici. Częściowo zróżnicowane amastigoty mają duży owalny kształt z krótkimi wiciami. Kultura nie powinna mieć wielu grudek - wiele grudek wskazuje na nierosnące, umierające pasożyty. Kulturę amastigoty można podzielić w stosunku 1:5 i utrzymywać przez maksymalnie 3 tygodnie.
4. Zakażenie L. amazonensis
- Rozcieńczyć zawiesiny pasożytów w zależności od pożądanej liczby infekcji (MOI) (zwykle 3-5 metacyklicznych promastigotów na makrofaga [MOI 1:3 lub 1:5] i 1 amastigota na makrofaga [MOI 1:1]). Dodać Leishmania w PBS -/- w objętości 50 - 100 μl do każdej studzienki zawierającej już 2 ml pożywki.
- Inkubować BMM przez 1 godzinę z amastigotami i 3 godziny z metacyklicznymi promastigotami w temperaturze 34 oC w celu zakażenia.
nuta: Optymalna temperatura infekcji może się różnić w zależności od gatunku.
- Po inkubacji dokładnie zmyć wolne pasożyty w każdym dołku 3x za pomocą 2 ml PBS -/- wstępnie podgrzanego do 37 °C.
nuta: Delikatnie rozprowadź PBS, aby upewnić się, że szkiełka nakrywkowe nie unoszą się jeden na drugim. Delikatnie zakręć płytką, a następnie odessaj płyn. Użyj oddzielnej końcówki zasysającej, jeśli używasz wielu szczepów pasożytów, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
- Ustalić 1 h lub 3 h punkty czasowe próbki, inkubując każdą studzienkę z 1,5 - 2 ml 2% PFA w PBS -/- przez 10 min. Przemyć 3x PBS -/-. Nie odsysać ostatniego mycia i przechowywać w lodówce płytki zawierające szkiełka nakrywkowe w PBS do czasu zabarwienia.
- Dodać 2 ml świeżej pożywki BMM do każdego dołka na płytkach w celu uzyskania dalszych punktów czasowych i inkubować w temperaturze 34 °C.
- Ustal pozostałe punkty czasowe zgodnie z potrzebami, jak opisano w kroku 4.3, i wstaw płytki do lodówki do czasu zabarwienia.
5. Barwienie 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) i montaż szkiełka nakrywkowego
- Odessać PBS ze studzienek zawierających szkiełka nakrywkowe i dodać 1,5 ml PBS -/- z 0,1% niejonowym detergentem. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie 3x przemyć 2 ml PBS -/-.
- Dodać 1 ml PBS -/- z 2 μg/ml DAPI (rozcieńczony z 5 mg/ml roztworu podstawowego w wodzie) do studzienek zawierających szkiełka nakrywkowe i inkubować przez kolejną 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
nuta: Czas inkubacji z DAPI ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej wizualizacji wewnątrzkomórkowych pasożytów Leishmania. Jądra makrofagów barwią się szybko, ze względu na ich większy rozmiar i zawartość kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA), ale barwienie jąder pasożytów wewnątrzkomórkowych jest wolniejsze. Tak więc wydłużenie czasu inkubacji poza to, co jest wymagane do wizualizacji jąder BMM, jest konieczne, aby DAPI mogło przeniknąć przez błonę plazmatyczną pasożyta i błonę jądrową pasożyta. Przy prawidłowym barwieniu DAPI oprócz DNA jądrowego można również uwidocznić mitochondrialne DNA kinetoplastu w pobliżu kieszeni wiciowej pasożyta.
- Umyj każdą studzienkę zawierającą szkiełka nakrywkowe 3x 2 ml PBS -/-, a następnie podnieś i odwróć szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszków, aby położyć komórkę stroną do dołu i zamocować na szklanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą dostępnego w handlu odczynnika do montażu zapobiegającego blaknięciu.
nuta: Szkiełka nakrywkowe są niezwykle delikatne i wymagają ostrożnego obchodzenia się. Unikaj wywierania na nie nacisku, zwłaszcza na ścianę boczną studni podczas podnoszenia. Dodanie kilku kropli PBS -/- zmniejsza napięcie powierzchniowe między szkiełkiem nakrywkowym a studzienką i ułatwia proces podnoszenia. Można użyć cienkiej igły, aby pomóc w podważeniu szkiełek nakrywkowych z dna studni. Po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego na szkiełku należy delikatnie docisnąć kleszkami, aby wypchnąć wszelkie pęcherzyki powietrza z nośnika montażowego. Jeśli szkiełko nakrywkowe zostało złamane lub prawdopodobnie przewróciło się podczas procesu podnoszenia, nie montuj go ponownie; Wystarczy użyć zapasowego czwartego szkiełka nakrywkowego.
- Szkiełka należy przechowywać w lodówce do momentu oznaczania ilościowego.
6. Kwantyfikacja infekcji
- Zbadaj szkiełka zabarwione DAPI pod mikroskopem fluorescencyjnym, skupiając się na makrofagach za pomocą soczewki obiektywowej 100X z olejkiem immersyjnym (wzbudzenie przy 358 nm; optymalna emisja przy 461 nm).
Upewnij się, że fokus jest skupiony na warstwie makrofagów między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym.
- Określ ilościowo liczbę makrofagów (dużych jąder barwionych DAPI) i liczbę mniejszych jąder amastigotów skupionych wokół każdego jądra makrofagów (patrz Rysunek 1A, DAPI) dla każdego pola widzenia, używając ręcznego licznika.
nuta: Nie wszystkie jądra Amastigotów mogą być widoczne w jednej płaszczyźnie ostrości ze względu na ich niewielkie rozmiary. Policz te, które są widoczne, gdy skupiasz się na jądrach makrofagów, a następnie użyj precyzyjnej ostrości, aby sprawdzić, czy w płaszczyznach powyżej i poniżej jąder makrofagów nie ma jąder pasożytów.
- Przejdź do innego pola widzenia, aby powtórzyć kwantyfikację. Użyj oddzielnego klucza licznika, aby śledzić liczbę zliczonych pól. Poruszaj się po polach widzenia w równoległych rzędach na każdym szkiełku nakrywkowym, aby zapobiec nakładaniu się liczenia.
- Określ ilościowo co najmniej 200 makrofagów na szkiełko nakrywkowe. Określić ilościowo każdy punkt czasowy infekcji w trzech egzemplarzach (3 szkiełka nakrywkowe). Policz czwarte szkiełko nakrywkowe, jeśli jedno z poprzednich nie nadaje się do liczenia z powodu nakładania się szkiełek nakrywkowych, złego montażu, stłuczenia szkła itp.
nuta: Jeśli nie można policzyć 200 makrofagów na jednym szkiełku nakrywkowym, policz zapasowe czwarte.
- Oblicz wskaźniki infekcji jako amastigoty/makrofagi lub amastigoty/100 makrofagów i określ procent zakażonych makrofagów na podstawie surowych danych ilościowych.
