Ilościowy pomiar fagocytozy zarodników grzybów metodą cytometrii przepływowej przez ludzkie fagocyty

Streszczenie

Źródło: Hartung, S., et al., Pomiar fagocytozy Aspergillus fumigatus Conidia przez ludzkie leukocyty przy użyciu cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje metodę ilościowego oznaczania fagocytozy patogennych zarodników grzybów znakowanych FITC przez ludzkie leukocyty. Zarodniki fagocytozowane są odróżniane od zarodników przylegających do komórek poprzez barwienie przeciwstawne, a następnie analizę cytometryczną przepływową.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Test fagocytozy

1. Inkubować 2 x 10⁶ leukocytów i 4 x 10⁶ konidiów znakowanych FITC (mnogość infekcji = 2) w 1,5 ml RPMI + 10% FCS na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. Jako kontrolki uwzględnij tylko komórki (bez konidiów) i komórki + nieoznakowane konidia.
2. Umieścić w nawilżonym inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C i inkubować przez żądany okres czasu (np. 0,5 h, 2 h lub 4 h).
3. Po inkubacji zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i umieścić ....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Folia samoprzylepna	marka	701367
Płytka do hodowli komórkowych, 12-dołkowa	Greiner Bio-one	Numer katalogowy: 665180
Cytometr	BD Nauki biologiczne		LSR Fortessa II, lasery: 488 nm (niebieski), 405 nm (fioletowy), 355 nm (UV) i 640 nm (czerwony)
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma Aldrich	ED3SS-500g	2 mM w PBS
Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)	Sigma Aldrich	F3651-100MG	0,1 mM w roztworze Na2CO3 /PBS
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy 189012-014	Bez wapnia, bez magnezu
Silnik RPMI 1640	ThermoFisher Naukowy	61870010	RPMI 1640 Medium, suplement GlutaMAX
Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych	BD Nauki biologiczne
Płyta dolna w kształcie litery V, 96 dołków	marka	781601	Nieobrobiona powierzchnia
Formaldehyd	Carla Rotha	Zobacz materiał PO87.3	Histofix