Ilościowy pomiar fagocytozy zarodników grzybów metodą cytometrii przepływowej przez ludzkie fagocyty

Streszczenie

Źródło: Hartung, S., et al., Pomiar fagocytozy Aspergillus fumigatus Conidia przez ludzkie leukocyty przy użyciu cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje metodę ilościowego oznaczania fagocytozy patogennych zarodników grzybów znakowanych FITC przez ludzkie leukocyty. Zarodniki fagocytozowane są odróżniane od zarodników przylegających do komórek poprzez barwienie przeciwstawne, a następnie analizę cytometryczną przepływową.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Test fagocytozy

1. Inkubować 2 x 10⁶ leukocytów i 4 x 10⁶ konidiów znakowanych FITC (mnogość infekcji = 2) w 1,5 ml RPMI + 10% FCS na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. Jako kontrolki uwzględnij tylko komórki (bez konidiów) i komórki + nieoznakowane konidia.
2. Umieścić w nawilżonym inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C i inkubować przez żądany okres czasu (np. 0,5 h, 2 h lub 4 h).
3. Po inkubacji zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i umieścić w probówce o pojemności 15 ml.
4. Wirować przez 5 minut w temperaturze 300 x g w temperaturze pokojowej.
5. Zebrać supernatant do analizy cytokin lub wyrzucić, jeśli nie jest to pożądane. Zawiesić każdą próbkę w 100 μl PBS + 2 mM EDTA.

2. Barwienie przeciwciał

1. Dla każdej próbki należy przygotować 100 μl mieszaniny przeciwciał, w tym przeciwciała anty-FITC APC, zgodnie z tabelą 1.
2. Umieścić próbkę o objętości 100 μl w jednym dołku 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Dodaj 150 μL PBS + 2 mM EDTA do prania.
3. W celu kompensacji koloru umieść 1 x 10⁶ komórek dla każdego koloru w dalszych dołkach 96-dołkowej płytki dolnej V. Dołącz studzienkę komórek, która pozostaje niepoplamiona. Dodaj 150 μL PBS + 2 mM EDTA do prania.
4. Przykryj płytkę folią samoprzylepną.
5. Wirować przez 5 minut w temperaturze 300 x g w temperaturze pokojowej. Usuń folię.
6. Supernatant należy wyrzucić, szybko i zdecydowanie odwracając talerz tylko raz nad zlewem lub jednorazowym ręcznikiem papierowym.
   UWAGA: Nie powtarzaj ani nie uderzaj płytką o papier, dopóki nie wyschnie, ponieważ spowoduje to ogromną utratę komórek z płytki.
7. Zawiesić komórki w mieszaninie przeciwciał o objętości 100 μl i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
8. W celu kompensacji barwy ponownie zawieś odpowiednie komórki w 100 μl PBS + 2 mM EDTA i dodaj pojedyncze przeciwciało do każdej studzienki w tej samej ilości, co w mieszaninie przeciwciał.
9. Przykryj folią samoprzylepną i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
10. Usuń folię. Dodaj 150 μl PBS + 2 mM EDTA do każdego dołka w celu umycia. Przykryj folią samoprzylepną.
11. Wirować przez 5 minut w temperaturze 300 x g w temperaturze pokojowej. Usuń folię. Wyrzuć supernatant, szybko i mocno odwracając talerz nad zlewem lub jednorazowym ręcznikiem papierowym.
12. Zawiesić ponownie w 200 μl PBS + 2 mM EDTA i przenieść komórki z każdej studzienki do oddzielnej probówki o okrągłym dnie. Upewnij się, że w zawiesinie nie ma skupisk komórek. W przeciwnym razie usuń klastry.
    UWAGA: Każda gromada, która jest wystarczająco duża, aby oko mogło ją zobaczyć, jest wystarczająco duża, aby potencjalnie zatkać cytometr.

3. Cytometria przepływowa

1. Uruchom cytometr przepływowy i pozwól mu się rozgrzać. Uruchom oprogramowanie do akwizycji.
2. Utwórz nowy eksperyment, a następnie skonfiguruj i oznacz próbki.
3. Ustaw parametry (FSC 250, SSC 250) i detektory dla fluoroforów FITC, APC, BUV395, V500 i PerCP-Cy5.5.
4. Konfiguracja wynagrodzenia
   1. Otwórz konfigurację kompensacji.
   2. Wskaż poszczególne kolory.
   3. Korzystając z komórek kontrolnych pozostawionych bez barwienia lub z indywidualnymi barwieniami, ustaw napięcia detektora PMT tak, aby obejmowały wszystkie zdarzenia w skali.
   4. Rejestrowanie co najmniej 10 000 zdarzeń każdej kontrolki.
   5. Użyj konfiguracji kompensacji, aby obliczyć rozlewanie się fluoroforów i zastosować je do ustawień cytometru eksperymentu.
5. Rejestrowanie przykładowych danych
   1. Wyświetl FSC i SSC w oprogramowaniu akwizycyjnym i ustaw bramkę wokół leukocytów.
   2. W oparciu o bramkę leukocytów, wyświetl wykres punktowy SSC / CD45 i bramkę dla komórek CD45 ⁺, aby oddzielić się od konidiów.
   3. Wyświetlaj komórki CD45 ⁺ na wykresie punktowym CD14 / CD66b i monocyty bramki (CD14 ⁺) i neutrofile (CD66b ⁺) oddzielnie.
   4. Wyświetlanie neutrofili w postaci anty-FITC/FITC na wykresie kropkowym.
   5. Używając próbki z nieznakowanymi konidiami, ustaw ćwiartki dla sygnałów anty-FITC i FITC, dopuszczając maksymalnie 1% komórek w odpowiednich kwadrantach.
   6. Powtórz kroki 3.5.4 i 3.5.5 dla bramki monocytów.
   7. Rejestruj wszystkie próbki z co najmniej 20 000 zdarzeń w bramce leukocytów.

Tabela 1: Mieszanina przeciwciał do cytometrii przepływowej. Ilości każdego odczynnika podaje się w mikrolitrach na próbkę (1 x 10⁶ komórek) do analizy.

szt.

Odczynnik	μl na próbkę
CD45 BUV395	1
CD14 V500	0,5
CD66b PerCP-Cy5.5	1,5
anty-FITC APC	0,5
PBS + 2 mM EDTA	97 Rozdział 97
łączny	100

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Folia samoprzylepna	marka	701367
Płytka do hodowli komórkowych, 12-dołkowa	Greiner Bio-one	Numer katalogowy: 665180
Cytometr	BD Nauki biologiczne		LSR Fortessa II, lasery: 488 nm (niebieski), 405 nm (fioletowy), 355 nm (UV) i 640 nm (czerwony)
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma Aldrich	ED3SS-500g	2 mM w PBS
Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)	Sigma Aldrich	F3651-100MG	0,1 mM w roztworze Na2CO3 /PBS
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy 189012-014	Bez wapnia, bez magnezu
Silnik RPMI 1640	ThermoFisher Naukowy	61870010	RPMI 1640 Medium, suplement GlutaMAX
Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych	BD Nauki biologiczne
Płyta dolna w kształcie litery V, 96 dołków	marka	781601	Nieobrobiona powierzchnia
Formaldehyd	Carla Rotha	Zobacz materiał PO87.3	Histofix