$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Synteza SPIO-MtbsAb
- Zsyntetyzować sprzężoną z SPIO 2,2'-(etylenodioksy)bisetyloaminę (EDBE) przy użyciu wcześniej opisanych metod.
- Synteza bezwodnika bursztynowego SPIO-EDBE (SA).
- Mieszać alkaliczny roztwór (5 M NaOH; 10 ml)) SPIO-EDBE i SA (1 g; 10 μmol) w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
- Dializować roztwór za pomocą 20 zmian po 2 l wody destylowanej za pomocą molekularnych porowatych rurek membranowych (odcięcie 12 000-14 000 MW). 6 godzin na każdą zmianę.
- Na koniec dodać 100 μl SPIO-EDBE-SA (4 mg/ml Fe) do 400 μl 4,5 mg/ml przeciwciała powierzchniowego Mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) w celu syntezy SPIO-MtbsAb przy użyciu 1-hydroksybenzotriazolu i (benzotriazol-1-yloksy) heksafluorofosforanu trirolidinofosfonii jako katalizatorów i mieszać roztwór w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
- Na koniec oddzielić roztwory od niezwiązanego przeciwciała za pomocą żelowej chromatografii filtracyjnej.
- Załadować mieszaninę reakcyjną (5 ml) do kolumny o średnicy 2,5 cm × 33 cm i wymyć za pomocą buforu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Potwierdź kompleks Ab-nanocząstki (tj. nanosondę) za pomocą zestawu do oznaczania białek kwasu bicinchoninowego.
2. Obserwacja morfologii cząstek i pomiar poziomu relaksacji
- Zbadaj średnią wielkość cząstek, morfologię i rozkład wielkości za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego przy napięciu 100 kV.
- Odlew dyspersję kompozytową na miedzianą siatkę o siatce 200 i wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej przed załadowaniem jej do mikroskopu.
- Zmierzyć wartości czasu relaksacji (T1 i T2) nanosond za pomocą relaksometru NMR przy 20 MHz i 37,0 °C ± 0,1 °C.
- Kalibruj relaksometr przed każdym pomiarem.
- Zapisać wartości r1 i r2 z ośmiu punktów danych wygenerowanych odpowiednio przez inwersję-odzysk i sekwencję impulsów Carra-Purcella-Meibooma-Gilla, aby określić relaksyjność r1 i r2.
3. Obrazowanie komórek
- Hodować ludzkie monocyty THP-1 w RPMI 1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą, 50 μg/ml siarczanu gentamycyny, 100 jednostek/ml penicyliny G, sodu 100 μg penicyliny G i 0,25 μg/ml fungizonu w inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Inkubować nanosondy SPIO-MtbsAb (2 mM) ze 106 jednostkami tworzącymi kolonie (CFU) Mycobacterium bovis BCG, wstępnie inkubowane z 1 × 10 7 aktywowanymi monocytami w probówkach do mikrowirówek (1 ml) w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
- Odwirować probówki o sile 200 x g i odrzucić supernatant. Ponownie rozpuść granulki w podłożu (200 μL).
- Skanuj próbki przy użyciu szybkiej sekwencji impulsów echa gradientowego (czas powtarzania (TR) = 500; Czas echa (TE) = 20; Kąt odwrócenia = 10°) przez rezonans magnetyczny 3,0-T w celu określenia specyficzności i czułości nanosondy.
4. Inokulacja BCG (Bacillus Calmette-Guérin)
- Rozpuść liofilizowaną szczepionkę lub wywar bakteryjny w pożywce Saautona, a następnie rozcieńcz wywar solą fizjologiczną, aż do prawidłowego rozproszenia, jak opisano wcześniej.
- Zaszczepić żywy atenuowany szczep M. bovis BCG, uzyskany z ADIMMUNE (Tajpej, Tajwan) (szczep Connaught; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) w objętości 0,1 ml / mysz (tj. 107 CFU) śródskórnie do lewej lub prawej skóry łopatki grzbietowej myszy, jak opisano wcześniej. Wstrzyknij sól fizjologiczną myszom jako kontrolę negatywną. Monitoruj zwierzęta codziennie po zaszczepieniu BCG.
- Składanie ofiar ze zwierząt 1 miesiąc po inokulacji bakteriami za pomocą eutanazji dwutlenkiem węgla. Pobrać tkankę z miejsca inokulacji śródskórnej. Utrwal tkankę w 10% formalinie i zanurz ją w parafinie dla seryjnych odcinków na 5-10 μm. Wybarwienia skrawków tkanek barwnikami hematoksylina/eozyna i Ziehl-Neelsen w przypadku bakterii kwasoodpornych oraz błękitem berlińskim w przypadku żelaza
żelazowego.
5. Rezonans magnetyczny in vivo
- Ketaminę (80 mg/kg masy ciała) i ksylazynę (12 mg/kg masy ciała) należy wstrzykiwać podskórnie myszom w celu znieczulenia zwierząt.
- Wstrzyknąć sondy SPIO-TbsAb (2 nmol/200 μl) do żył ogonowych myszy. Myszy z obrazem MR przed i bezpośrednio po wstrzyknięciu sondy, a następnie co 5 minut przez 30 minut w celu uzyskania T2-zależnych szybkich obrazów echa spinowego (TR = 3000; TE = 90; pole widzenia = 8).
- Ilościowo przeanalizuj wszystkie obrazy MR za pomocą intensywności sygnału (SI), pomiaru zdefiniowanych obszarów zainteresowania w porównywalnych lokalizacjach centrum ziarniniaka Mtb i mięśnia pleców przylegającego do obszaru ziarniniakowego.
- Oblicz względne wzmocnienia sygnału na podstawie pomiaru SI przed (SIpre; kontrola) i 0-3 h po (SIpost) wstrzyknięciu środków kontrastowych za pomocą wzoru
[(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100
gdzie SIpre jest SI zmiany na wstępnie ulepszonym skanie, a SIpost jest SI zmiany na skanie po poprawieniu.