Ocena aktywacji wielu kaspaz w makrofagach

Streszczenie

Źródło: Han, J. et al., Ocena aktywacji kaspazy w celu oceny wrodzonej śmierci komórek odpornościowych.J. Vis. Exp.(2023)

Ten film pokazuje ocenę wielokrotnych aktywacji kaspazy w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego poprzez stymulację wirusem grypy. Po lizie makrofagów, inaktywacji termicznej lizatu i odwirowaniu pobiera się kaspazy wewnątrzkomórkowe do późniejszej analizy immunologicznej.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów

1. Przygotować pożywkę kondycjonowaną pod kątem L929.
   1. Płytka 1 × 10⁶ komórek L929 (patrz tabela materiałów) w kolbie do hodowli tkankowej o długości 182^cm2 zawierającej 50 ml pożywki L929 (patrz tabela 1 w celu przygotowania pożywki).
   2. Hoduj komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla, CO₂ .
   3. Po 7 dniach zebrać supernatant i przefiltrować za pomocą filtra 0,45 μm. Przygotować 50 ml porcji (zamrożone porcje przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku).
2. Przygotować 500 ml pożywki hodowlanej makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) (Tabela 1).
3. Przygotuj 500 ml pożywki stymulacyjnej BMDM (Tabela 1).
4. Przygotować 500 ml pożywki do zakażenia (Tabela 1).
5. Przygotować 100 ml 1 M buforu Tris (Tabela 1).
6. Przygotować 4x bufor dodecylosiarczanu sodu (SDS) (Tabela 1).
7. Przygotować 1 ml 1 M 1,4-ditiotreitolu (NTC, Tabela 1).
8. Przygotować 40 ml buforu do lizy kaspazy (Tabela 1).
9. Przygotować 100 ml 1,5 M buforu Tris (Tabela 1).
10. Przygotować 100 ml 10% (wag./obj.) roztworu SDS (Tabela 1).
11. Przygotować 50 ml 2x buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) (Tabela 1).
12. Przygotować roztwór LPS o stężeniu 5 mg/ml lipopolisacharydu (Tabela 1).
13. Przygotować 0,5 M roztwór adenozynotrifosforanu ATP (Tabela 1).
14. Przygotuj roztwory western blotting.
    1. Przygotować 1 l 5-krotnego bieżącego zapasu buforowego (tabela 1).
    2. Przygotować 1 l 10-krotnego zapasu buforowego (tabela 1).
    3. Przygotować 1 l soli fizjologicznej buforowanej Tris za pomocą Tween 20 (TBST, Tabela 1).
    4. Przygotować 100 ml 5% (wag./obj.) roztworu blokującego mleko odtłuszczone (Tabela 1).
15. Przygotuj pierwszorzędowe roztwory przeciwciał.
    1. Przygotować 10 ml pierwszorzędowego przeciwciała kaspazy-1 (Tabela 1).
    2. Przygotować 10 ml pierwszorzędowego przeciwciała kaspazy-11 (Tabela 1).
    3. Przygotować 10 ml pierwszorzędowego przeciwciała kaspazy-3 (Tabela 1).
    4. Przygotuj 10 ml pierwszorzędowego przeciwciała kaspazy-7 (Tabela 1).
    5. Przygotować 10 ml pierwszorzędowego przeciwciała kaspazy-8 (Tabela 1).
    6. Przygotować 10 ml pierwszorzędowego przeciwciała kaspazy-9 (Tabela 1).
    7. Przygotować 10 ml sprzężonego z HRP przeciwciała pierwszorzędowego β-aktyny (Tabela 1).
16. Przygotować drugorzędowe roztwory przeciwciał.
    1. Przygotować 10 ml drugorzędowego przeciwciała anty-królika (Tabela 1).
    2. Przygotować 10 ml przeciwciała drugorzędowego przeciwko myszom (Tabela 1).
    3. Przygotować 10 ml przeciwciała drugorzędowego przeciwko szczurom (Tabela 1).

2. Izolowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

UWAGA: Do tego protokołu można użyć 6-10-tygodniowych myszy typu dzikiego z nienaruszonymi szlakami programowanej śmierci komórkowej (PCD) lub zmutowane myszy z usuniętymi lub zmienionymi regulatorami PCD, efektorami lub cząsteczkami będącymi przedmiotem zainteresowania.

1. Poddaj mysz eutanazji w komorze CO₂ o natężeniu przepływu, które przemieszcza 10%-30% objętości klatki na minutę przez 2-3 minuty. Następnie wykonaj wtórną metodę eutanazji, taką jak zwichnięcie szyjki macicy. W stosownych przypadkach należy przestrzegać wszystkich dodatkowych wytycznych i przepisów dotyczących poszczególnych placówek, instytucji i rządów.
2. Przeprowadź sekcję myszy, aby odzyskać kości tylnej nogi.
   1. Przypnij mysz do pleców, aby brzuch był odsłonięty. Spryskaj 70% (obj./obj.) etanolem, aby wysterylizować tylne nogi i brzuch.
      ostrożność: Etanol jest łatwopalny. Trzymaj go z dala od otwartego ognia.
   2. Użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej brzucha; kontynuuj cięcie w kierunku nóg, aby kości udowe były widoczne.
   3. Chwyć prawą tylną nogę i odciągnij skórę od ciała w kierunku linii środkowej. Odłącz nogę od ciała, przecinając mięśnie przywodzicieli w kierunku linii środkowej; Następnie przetnij nogę między stawem biodrowym a kręgosłupem. Następnie odetnij łapę dystalnie do kostki i usuń nadmiar tkanki z kości, odrywając skórę i używając lekko otwartych nożyczek, aby usunąć tkankę łydki.
   4. Połóż nogę na ręczniku nasączonym etanolem o stężeniu 70% (obj. / obj.) i rozetnij kość piszczelową i kość udową.
      1. Zapnij kość piszczelową i udową, każdy z osobnym zestawem kleszczy. Delikatnie dociśnij piszczel do naturalnego kierunku stawu kolanowego; Spowoduje to złamanie kości piszczelowej w kolanie.
      2. W razie potrzeby użyj kleszczy i nożyczek preparacyjnych, aby usunąć pozostałą zwisającą tkankę. Zachowaj piszczel do późniejszego wykorzystania, umieszczając ją na ręczniku nasączonym etanolem.
      3. Zbierz kość udową w ten sam sposób, odrywając się od kolana.
   5. Powtórz kroki 3 i 4 powyżej dla lewej nogi, aby usunąć ją z ciała i wyciąć kość piszczelową i udową.
   6. Spryskaj kości 70% (obj./obj.) etanolem.
   7. Oczyść kości, umieszczając je na czystym ręczniku nasączonym etanolem o stężeniu 70% (vol/vol), ściskając mięsistą część ręcznika i pocierając ręcznikiem o kość, aby usunąć nadmiar tkanki.
3. Gdy obie kości udowe i obie piszczele są czyste, spryskaj wszystkie cztery kości 70% (obj. / obj.) etanolem. Zebrać kości na sterylnej szalce Petriego i opłukać je 10 ml pożywki hodowlanej BMDM, delikatnie przesuwając pożywkę w naczyniu.
4. Napełnić strzykawkę o pojemności 10 ml 10 ml świeżej pożywki hodowlanej BMDM i założyć igłę 25 G.
5. Podnieś kość piszczelową za pomocą kleszczy, a następnie przetnij staw skokowy pod kątem ~45°.
6. Wypłucz szpik kostny z kości piszczelowej.
   1. Trzymaj kość piszczelową nad probówką o pojemności 50 ml, tak aby wąski koniec kości piszczelowej był skierowany w dół. Dozować pożywkę na piszczel z napełnionej strzykawki.
   2. Wprowadzić igłę (na początku delikatnie) w górny koniec szpiku i dozować pożywkę.
   3. Wyjąć igłę, a następnie włożyć ją ponownie. Użyj krótkich, wysokociśnieniowych naciśnięć, aby dozować pożywkę i wsunąć igłę do szpiku.
   4. Gdy podłoże zacznie wypływać z dna kości, użyj krótkich, wysokociśnieniowych pchnięć, aby kontynuować wypłukiwanie komórek. Monitoruj kolor kości podczas tego procesu, a gdy kość jest biała, wyrzuć ją.
   5. Zrób to dla obu piszczeli.
7. Powtórz kroki 5 i 6 powyżej dla kości udowych, przecinając staw biodrowy, tak jak kość piszczelowa została przecięta w stawie skokowym. Użyj tej samej probówki o pojemności 50 ml do zebrania pożywki hodowlanej BMDM podczas płukania szpiku.
8. Po przepłukaniu wszystkich czterech kości, odessać szpik i pożywkę z probówki 50 ml w górę i w dół 3x przez igłę 18 G na strzykawce o pojemności 10 ml, za każdym razem płucząc boki probówki w celu rozproszenia szpiku.
9. Dostosuj końcową objętość w probówce o pojemności 50 ml do 30 ml za pomocą pożywki hodowlanej BMDM i upewnij się, że komórki są dokładnie zawieszone.
10. Użyj sitka do komórek o wielkości 70 μm, aby przefiltrować pożywkę hodowlaną BMDM z probówki o pojemności 50 ml.
11. Powstałą zawiesinę komórkową, która zawiera komórki progenitorowe szpiku kostnego, należy umieścić na trzech 150-milimetrowych szalkach do hodowli tkankowych, dodając do każdej z nich 10 ml (lub ~20 × 10⁶ komórek). Następnie dodaj dodatkowe 10 ml pożywki hodowlanej BMDM do każdego naczynia. Inkubować w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C.

3. Rozróżnianie BMDM i poszycie do eksperymentów

1. Inkubować posiane komórki progenitorowe szpiku kostnego w temperaturze 37 °C przez 3 dni. Następnie wyjmij każdą szalkę i dodaj dodatkowe 5-8 ml pożywki hodowlanej BMDM (Tabela 1). Wrócić do inkubatora w temperaturze 37 °C.
2. W 5 dniu po początkowym posiewie wyjmij każdą szalkę i dodaj dodatkowe 5 ml pożywki hodowlanej BMDM. Wrócić do inkubatora w temperaturze 37 °C.
3. W 6 dniu wyjmij każde naczynie i wyrzuć nośnik. Następnie dodać 10 ml zimnej (przechowywanej w temperaturze 4 °C) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do jednokrotnego przemycia. Wyrzuć 10 ml zimnego prania PBS. Następnie dodaj 10 ml świeżego, zimnego PBS do każdego dania i inkubuj każde danie na lodzie przez 5 minut.
4. Za pomocą skrobaka do komórek delikatnie zeskrob komórki ze wszystkich trzech naczyń do jednej probówki o pojemności 50 ml. Delikatnie odwirowywać komórki w temperaturze 270 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut; Następnie odrzuć supernatant.
5. Dodać 20 ml pożywki hodowlanej BMDM, pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić osad i policzyć komórki.
   nuta: Oczekuje się, że każda mysz da około 60 × 10 6-100 × 10⁶ komórek.
6. Zaplanuj układ 12-dołkowej płytki dla pożądanego testu stymulacji śmierci komórki/stanu zapalnego in vitro. Zaplanuj płytowanie 1 × 10⁶ komórek na dołek. Dla każdej planowanej stymulacji należy uwzględnić co najmniej trzy kontrpróby biologiczne i umieścić jeden zestaw studzienek do zbioru w buforze do lizy kaspazy i drugi zestaw studzienek, które mają być zebrane w buforze RIPA.
7. Płytka 1 × 10⁶ komórek w 1 ml pożywki hodowlanej BMDM na dołek na płytkach 12-dołkowych. Hodowla przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C przed przystąpieniem do oceny śmierci komórki/stanu zapalnego. Po całonocnej inkubacji usunąć pożywkę i dodać 1 ml ciepłego (37 °C) PBS do każdej studzienki w celu przemycia komórek.
8. Usunąć płukanie PBS i dodać 500 μl pożywki stymulującej BMDM z antybiotykami (w przypadku stymulacji niebakteryjnej) lub pożywki stymulującej BMDM bez antybiotyków (w przypadku wykonywania stymulacji bakteryjnej) (Tabela 1). Inkubować przez 2 godziny przed przejściem do etapu 4 w celu stymulacji/zakażenia in vitro.

4. Stymulowanie lub infekowanie komórek

UWAGA: Czynniki zawarte w tym protokole są potencjalnie chorobotwórcze i powinny być traktowane z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) za zgodą odpowiednich władz instytucjonalnych i rządowych.

1. Stymuluj BMDM do aktywacji śmierci komórki za pomocą wyzwalacza zainteresowania.
   nuta: Do celów niniejszego protokołu stosuje się wirusa grypy A (IAV), wirusa opryszczki pospolitej 1 (HSV1), Francisella novicida i LPS + ATP, ale można zastosować inne czynniki wyzwalające.
   1. Przykładowa stymulacja 1: Zakażenie wirusem IAV (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) (skonstruowanym zgodnie z Hoffmannem i wsp.; miano wirusa do określenia wielokrotności infekcji [MOI] oblicza się za pomocą testu płytki nazębnej w komórkach MDCK):
      1. Obliczyć objętość wirusa potrzebną do zakażenia przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 20 jednostek tworzących blaszkę (PFU), korzystając z równania (1) i równania (2):
         
         
         
   2. Usunąć pożywkę z BMDM i przemyć ogniwa raz 500 μl PBS. Dodaj 450 μl IAV (20 MOI) w DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, (HI)-FBS do każdej studzienki. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w wilgotnym inkubatorze, aby umożliwić wchłonięcie.
   3. Usunąć płytki i dodać 50 μl HI-FBS. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Inkubować przez 12 godzin.

5. Zbieranie połączonego supernatantu i lizatu białkowego do użycia w kaspazie western blot

1. Po 4 godzinach, 12 godzinach lub 16 godzinach inkubacji (konkretny czas zależy od użytego spustu) wyjąć płytkę z inkubatora.
2. Usunąć 150 μl supernatantu; wyrzucić lub zachować to do innych analiz nad osadem (np. testu immunoenzymatycznego [ELISA]). Nie usuwać pozostałego supernatantu.
3. Stworzyć roztwór do zbierania białek, łącząc 50 μl buforu do lizy kaspazy + 100 μl 4x buforu SDS na studzienkę (Tabela 1). Następnie dodaj 150 μl mieszanki do każdej studzienki.
4. Dla każdego dołka należy pipetować mieszaninę w górę i w dół, aby zebrać zlizowane komórki i supernatant. Podczas pipetowania należy również zeskrobać dno studzienki końcówką pipety, aby rozbić komórki. Po zeskrobaniu i pipetowaniu zebrać lizat białkowy do oznakowanych probówek o pojemności 1,5 ml.
5. Za pomocą bloku grzewczego podgrzej wszystkie probówki do 100 °C przez 12 minut.
6. Granulować dowolne nierozpuszczalne składniki, odwirowując w temperaturze 14 500 × g przez 30 s w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Jest to punkt przerwy - białko z połączonego supernatantu i lizatów białkowych może być albo zużyte natychmiast, albo przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do 2 miesięcy lub w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy, aż będzie gotowe do użycia.

.

kategoria	Odczynniki	preparat	Uwagi	Środki ostrożności
Media	Pożywki L929	1) Dezaktywuj termicznie FBS (patrz uwagi). 2) Połącz 43,5 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove (IMDM), 5 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (HI-FBS), 0,5 ml pirogronianu sodu, 0,5 ml aminokwasów endogennych oraz 0,5 ml penicyliny i streptomycyny.	Inaktywować termicznie FBS przez inkubację w temperaturze 56 °C przez 30 min.
	Pożywki hodowlane makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM)	Połącz 290 ml IMDM, 150 ml pożywki kondycjonowanej L929 i 5 ml aminokwasów endogennych, 50 ml HI-FBS oraz 5 ml penicyliny i streptomycyny.	Przed użyciem podgrzać podłoże do temperatury 37 °C w kąpieli wodnej lub perełkowej. Media można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
	Pożywki stymulujące BMDM z antybiotykami	Połącz 445 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, 50 ml HI-FBS oraz 5 ml penicyliny i streptomycyny.	Przed użyciem podgrzać podłoże do temperatury 37 °C w kąpieli wodnej lub perełkowej. Media można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
	Pożywki stymulacyjne BMDM bez antybiotyków	Połącz 450 ml DMEM i 50 ml HI-FBS.	Przed użyciem podgrzać podłoże do temperatury 37 °C w kąpieli wodnej lub perełkowej. Media można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
	Pożywka do infekcji (bez HI-FBS)	Połącz 495 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 5 ml penicyliny i streptomycyny.	Przed użyciem podgrzać podłoże do temperatury 37 °C w kąpieli wodnej lub perełkowej. Media można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
Bufor dodecylosiarczanu sodu (SDS)	1 M bufor Tris (dla 4x bufor SDS)	1) Rozpuść 12,11 g Tris w 80 ml wody dejonizowanej. 2) Dostosuj pH do 6,8, dodając krople HCl, mieszając. 3) Dodaj wodę dejonizowaną, aby dostosować końcową objętość do 100 ml.	Bufor może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.	HCl jest. Zawsze nosić odpowiednie środki ochrony osobistej; Obejmuje to fartuch laboratoryjny i rękawice. HCl należy obchodzić się z dygestoriami.
	4x bufor SDS	1) Połącz 60 ml 1 M roztworu Tris (pH 6,8), 24 mg SDS, 100 mg błękitu bromofenolowego, 120 ml glicerolu, 8,4 ml β-merkaptoetanolu (BME) i 90 ml wody dejonizowanej. 2) Wymieszaj na rozgrzewającej płytce do mieszania, aby sole mogły dostać się do roztworu. 3) Dodaj wodę dejonizowaną, aby dostosować końcową objętość do 300 ml.	Bufor może być porcjowany i przechowywany w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.	SDS jest, a BME jest rakotwórczy. Zawsze nosić odpowiednie środki ochrony osobistej; Obejmuje to fartuch laboratoryjny i rękawice. SDS i BME należy obchodzić się w dygestorium.
Bufor do lizy kaspazy	1 M 1,4-ditiotreitol (DTT)	Rozpuścić 0,154 g proszku DTT w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Zezwól na wejście DTT do rozwiązania.	Bufor może być podzielony na 200 μl podwielokrotności i przechowywany w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
	Bufor do lizy kaspazy	Połącz 35 ml wody dejonizowanej, 4 ml NP-40, 750 μl 1 M DTT, 1 tabletkę inhibitora proteazy i 1 tabletkę inhibitora fosfatazy.	Bufor może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
Bufor do badania radioimmunoprecypitacji (RIPA)	1,5 m bufor Tris (dla bufora RIPA)	1) Rozpuść 18,2 g Tris w 80 ml wody dejonizowanej. 2) Dostosuj pH do 8,8, dodając krople NaOH podczas mieszania. 3) Dodaj wodę dejonizowaną, aby dostosować końcową objętość do 100 ml.	Bufor może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.	NaOH jest i może powodować oparzenia. Zawsze nosić odpowiednie środki ochrony osobistej; Obejmuje to fartuch laboratoryjny i rękawice.
	10% (wag./obj.) roztwór SDS (dla bufora RIPA)	1) Dodaj 10 g SDS do 80 ml wody dejonizowanej. 2) Mieszaj aż do rozpuszczenia. 3) Dodaj wodę dejonizowaną, aby dostosować końcową objętość do 100 ml.	Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy. Jeśli roztwór się wytrąci, delikatnie podgrzej, aby ponownie się rozpuścił.	SDS jest. Zawsze nosić odpowiednie środki ochrony osobistej; Obejmuje to fartuch laboratoryjny i rękawice. Z SDS należy obchodzić się w dygestorium.
	Bufor RIPA (2x kolba)	1) Połącz 0,5 g deoksycholanu sodu, 1 ml NP-40, 0,876 g NaCl, 3,3 ml 1,5 M Tris (pH 8,8) i 1 ml 10% (wag./obj.) SDS w 46 ml wody dejonizowanej. 2) Mieszaj aż do rozpuszczenia. 3) Dodaj wodę dejonizowaną, aby dostosować końcową objętość do 50 ml.	2x RIPA stock może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.	SDS jest. Zawsze nosić odpowiednie środki ochrony osobistej; Obejmuje to fartuch laboratoryjny i rękawice. Z SDS należy obchodzić się w dygestorium.
Sterylne spusty	Lps	Rozpuścić liofilizowany LPS z E. coli 0111:B4 w wodzie wolnej od endotoksyn do stężenia 5 mg/ml.	Roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 2 lat.
	0,5 mln ATP	Rozpuść 1 g liofilizowanego ATP w 3,63 ml wody wolnej od endotoksyn	Roztwór można podatkować i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 2 lat.
Zachodnie rozwiązania do blottingu	Uruchomiony bufor (5x w magazynie)	1) Połącz 15 g zasady Tris, 72 g glicyny i 5 g SDS w 900 ml wody dejonizowanej. 2) Mieszaj, aż nie pozostaną żadne cząstki. 3) Dodaj wodę dejonizowaną, aby dostosować końcową objętość do 1 l.	Bufor może być przechowywany w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.	SDS jest. Zawsze nosić odpowiednie środki ochrony osobistej; Obejmuje to fartuch laboratoryjny i rękawice. Z SDS należy obchodzić się w dygestorium.
	Bufor transferowy (10x zapas)	1) Połącz 30,3 g zasady Tris i 72 g glicyny w 900 ml wody dejonizowanej. 2) Mieszaj, aż nie pozostaną żadne cząstki. 3) Dodaj wodę dejonizowaną, aby dostosować końcową objętość do 1 l.	Bufor może być przechowywany w temperaturze pokojowej do 3 miesięcy.
	Sól fizjologiczna buforowana trisem z Tween 20 (TBST)	1) Rozpuść 2,42 g zasady Tris i 8,76 g NaCl w 850 ml wody dejonizowanej. 2) Dostosuj pH do 7,4, dodając krople HCl, mieszając. 3) Dodaj wodę dejonizowaną, aby dostosować końcową objętość do 1 L. 4) Dodać 0,5 ml Tween 20 (końcowe stężenie 0,05% (vol/vol)).	Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 miesiąc.	HCl jest. Zawsze nosić odpowiednie środki ochrony osobistej; Obejmuje to fartuch laboratoryjny i rękawice. HCl należy obchodzić się z dygestoriami.
	5% (wag./obj.) roztwór blokujący mleko odtłuszczone	Rozpuścić 5 g odtłuszczonego mleka w proszku w 100 ml TBST.	Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
Przeciwciała pierwszorzędowe	Pierwszorzędowe przeciwciało kaspazy-1	Rozcieńczyć przeciwciało anty-kaspazy-1 w stosunku 1:1 000 (obj./obj.), dodając 10 μl przeciwciała do 10 ml 5% (wag./obj.) roztworu blokującego mleko odtłuszczone.	Aby uzyskać optymalne wyniki, przygotuj świeżość do każdego eksperymentu. Jednak to rozwiązanie może być użyte co najmniej 3 razy bez utraty skuteczności. Przechowywać w temperaturze -20 °C w przypadku ponownego użycia.
	Pierwszorzędowe przeciwciało kaspazy-11	Rozcieńczyć przeciwciało anty-kaspazy-11 w stosunku 1:1 000 (obj./obj.), dodając 10 μl przeciwciała do 10 ml 5% (wag./obj.) odtłuszczonego roztworu blokującego mleko.	Aby uzyskać optymalne wyniki, przygotuj świeżość do każdego eksperymentu. Jednak to rozwiązanie może być użyte co najmniej 3 razy bez utraty skuteczności. Przechowywać w temperaturze -20 °C w przypadku ponownego użycia.
	Pierwszorzędowe przeciwciało kaspazy-3	Rozcieńczyć przeciwciało anty-kaspazy-3 i przeciwciało przeciw rozszczepieniu kaspazy-3 w stosunku 1:1,000 (obj./obj.), dodając 10 μl każdego przeciwciała do tych samych 10 ml 5% (wag./obj.) roztworu blokującego mleko odtłuszczone.	Aby uzyskać optymalne wyniki, przygotuj świeżość do każdego eksperymentu. Jednak to rozwiązanie może być użyte co najmniej 3 razy bez utraty skuteczności. Przechowywać w temperaturze -20 °C w przypadku ponownego użycia.
	Pierwszorzędowe przeciwciało kaspazy-7	Rozcieńczyć przeciwciało anty-kaspazy-7 i przeciwciało przeciw rozszczepieniu kaspazy-7 w stosunku 1:1,000 (obj./obj.), dodając 10 μl każdego przeciwciała do tych samych 10 ml 5% (wag./obj.) roztworu blokującego mleko odtłuszczone.	Aby uzyskać optymalne wyniki, przygotuj świeżość do każdego eksperymentu. Jednak to rozwiązanie może być użyte co najmniej 3 razy bez utraty skuteczności. Przechowywać w temperaturze -20 °C w przypadku ponownego użycia.
	Pierwszorzędowe przeciwciało kaspazy-8	Rozcieńczyć przeciwciało anty-kaspazy-8 i przeciwciało przeciw rozszczepieniu kaspazy-8 w stosunku 1:1,000 (obj./obj.), dodając 10 μl każdego przeciwciała do tych samych 10 ml 5% (wag./obj.) roztworu blokującego mleko odtłuszczone.	Aby uzyskać optymalne wyniki, przygotuj świeżość do każdego eksperymentu. Jednak to rozwiązanie może być użyte co najmniej 3 razy bez utraty skuteczności. Przechowywać w temperaturze -20 °C w przypadku ponownego użycia.
	Pierwszorzędowe przeciwciało kaspazy-9	Rozcieńczyć przeciwciało anty-kaspazy-9 w stosunku 1:1 000 (obj./obj.), dodając 10 μl przeciwciała do 10 ml 5% (wag./obj.) odtłuszczonego roztworu blokującego mleko.	Aby uzyskać optymalne wyniki, przygotuj świeżość do każdego eksperymentu. Jednak to rozwiązanie może być użyte co najmniej 3 razy bez utraty skuteczności. Przechowywać w temperaturze -20 °C w przypadku ponownego użycia.
	Przeciwciało pierwszorzędowe β-aktyny sprzężone z HRP	Rozcieńczyć przeciwciało anty-β-aktyny w stosunku 1:5 000 (obj./obj.), dodając 2 μl przeciwciała do 10 ml 5% (wag./obj.) roztworu blokującego mleko odtłuszczone.	Przeciwciało to powinno być przygotowywane świeże do każdego eksperymentu.
Przeciwciała drugorzędowe	Przeciwciało anty-królicze	Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) w stosunku 1:5 000 (obj. i obj.), dodając 2 μl przeciwciała do 10 ml 5% (wag./obj.) roztworu blokującego mleko odtłuszczone.	Rozcieńczenie przeciwciał należy za każdym razem przygotowywać na świeżo.
	Przeciwciało anty-mysie	Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP w stosunku 1:5 000 (obj. i obj.), dodając 2 μl przeciwciała do 10 ml 5% (wag./obj.) roztworu blokującego mleko odtłuszczone.	Rozcieńczenie przeciwciał należy za każdym razem przygotowywać na świeżo.
	Przeciwciało przeciw szczurom	Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP w stosunku 1:5 000 (obj. i obj.), dodając 2 μl przeciwciała do 10 ml 5% (wag./obj.) roztworu blokującego mleko odtłuszczone.	Rozcieńczenie przeciwciał należy za każdym razem przygotowywać na świeżo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filtr 0,45 μm	Milipory	SCHVU05RE
Strzykawka 10 ml	BD Nauki biologiczne	309604
Płytka 12-dołkowa	Corning	07-200-82
Igła 18 G	BD Nauki biologiczne	305195
Igła 25 G	BD Nauki biologiczne	305122
Probówka 50 ml	Fisher Naukowy	50-809-218
Sitko do komórek 70 μm	Corning	431751
Szalki do hodowli tkankowych 150 mm	Corning	430597
Kolba do hodowli tkankowych o pojemności 182 cm2	Genesee Scientific	25-211
Atp	InvivoGen	tlrl-atpl
BBL Tryptikaza Rosół sojowy	BD Nauki biologiczne	211768
Kąpiel z koralikami	Chemglass Nauki przyrodnicze	CLS-4598-009
Biofotometr D30	Eppendorf	6133000010
Skrobaki komórkowe	Produkty naukowe CellTreat	229315
Komora CO2	Wyposażenie weterynaryjne	901703
Kuwety	Fisher Naukowy	14-955-129
Nożyczki preparacyjne	Thermo Fisher Naukowy	221S
DMEM (DMEM)	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy 11995-073
etanol	Pharmco	111000200
Surowica bydlęca płodu	Biowest (Zachód Biologi	Zobacz materiał S1620
Bibuła filtracyjna	Bio-Rad	1703965
Kleszcze	Fisher Naukowy	22-327379
Francisella novicida (szczep U112)	Zasoby BEI	Zobacz materiał NR-13
Gentamycyna	Gibco (firma Gibco)	15750060
Blok grzewczy	Fisher Naukowy	23-043-160
Wirus opryszczki pospolitej 1 (szczep HF)	Kontroler ATCC (Kontroler T	Kamera VR-260
DMEM o wysokim poziomie glukozy	Sigma	Zobacz materiał D6171
Inkubator nawilżany	Thermo Fisher Naukowy	51026282
IMDM (Międzynarodowa Organizacja Zarządzania	Thermo Fisher Naukowy	12440-053
Wirus grypy A (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])	skonstruowany za Hoffmann et al.
Ogniwa L929	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał CCL-1	Linia komórkowa do tworzenia pożywek kondycjonowanych L929
L-cysteina	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP376-100
Ogniwa MDCK	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał CCL-34	Linia komórkowa do oznaczania miana wirusa IAV
Mikrowirówka	Thermo Fisher Naukowy	75002401
Aminokwasy endogenne	Gibco (firma Gibco)	11140050
Roztwór NP-40	Sigma	492016
Pbs	Thermo Fisher Naukowy	10010023
Penicylina i streptomycyna	Sigma	Zobacz materiał P4333
szalka Petriego	Fisher Naukowy	07-202-011
Detektor PhosSTOP	Roche	PHOSS-RO
Źródło zasilania	Bio-Rad	164-5052
Tabletka inhibitora proteazy	Sigma	Zobacz materiał S8820
wodorotlenek sodu	Sigma	Numer katalogowy: 72068
Pirogronian sodu	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 11360-070
Kwadratowa szalka Petriego	Fisher Naukowy	FB0875711A
Wirówka stołowa	Thermo Fisher Naukowy	75004524
Ultraczysty lipopolisacharyd (LPS) z E. coli 0111:B4	InvivoGen	TLRL-3PELPS
Komórki Vero	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał CCL-81	Linia komórkowa do oznaczania miana wirusa HSV1

powiedział: T powiedział: