Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Dzień 1
UWAGA: Wykonaj wszystkie opisane poniżej kroki w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, używanej do hodowli tkanek w laboratorium BSL-2.
- Rozmrozić próbki surowicy w temperaturze pokojowej i przenieść 100 μl każdej próbki surowicy do sterylnej probówki. Podgrzewać przez 30 minut w temperaturze 56°C w łaźni wodnej lub termomikserze o regulowanej temperaturze. Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia próbki surowicy w zakresie od 1:1 do 1:1,000 przy użyciu zimnego RPMI-10 (RPMI z 10% płodową surowicą bydlęcą).
- Przenieść 10 μl seryjnie rozcieńczonej próbki surowicy do każdego dołka sterylnej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Uwzględnij dwa zestawy studzienek kontrolnych, RPMI-10 tylko z RVP i bez próbki surowicy oraz RPMI-10 tylko bez RVP i bez próbki surowicy. Ustawić każdą próbkę surowicy i kontrolki RPMI-10 w trzech egzemplarzach.
- Wyjąć RVP Dengue-1, 2, 3 i 4 z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrozić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Natychmiast przenieś rozmrożone RVP na lód. Uzyskać około 170 μl RVP dla każdej próbki surowicy (10 μl RVP x 3 dołki na każde rozcieńczenie surowicy (1:1, 1:10, 1:100, 1:1,000) i 10 μl RVP x 3 dołki dla każdego z RPMI-10 z dołkami kontrolnymi tylko RVP).
- Odpipetować 10 μl RVP do każdego dołka 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V zawierającej próbkę surowicy i do RPMI-10 z dołkami kontrolnymi RVP (bez surowicy). Nie dodawaj RVP tylko do dołków RPMI-10 (bez próbki surowicy i bez RVP). Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 5–10 razy. Dodaj 10 μl zimnego RPMI-10 zamiast RVP do każdej zimnej studzienki kontrolnej RPMI-10 (bez próbki surowicy i bez RVP).
- Przenieść 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V do inkubatora i inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 . Podczas inkubacji 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V, oczyść powierzchnię komory bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem i włącz światło UV na 15 minut.
- Wyjąć z inkubatora w pełni zlewającą się kolbę T75 z komórkami K562, dobrze wymieszać komórki za pomocą sterylnej pipety o pojemności 5 ml i przenieść 5 ml komórek do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.
nuta: Komórki K562 są utrzymywane w RPMI-10 i subhodowane w temperaturze 1 x 106/ml.
- Policz liczbę komórek, usuwając 10 μl komórek ze sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wymieszaj z 10 μl błękitu tryphanowego. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby określić całkowitą liczbę komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
- Odwirować 15 ml stożkowy z komórkami przy ~1,200 x g przez 10 minut, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w ciepłym RPMI-10 o stężeniu 80 000 komórek/30 μL pożywki (2,66 x 106 komórek / ml).
- Wyjąć 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V z inkubatora (krok 1.6), przenieść 30 μl komórek K562 do każdego dołka 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół 5–10 razy. Przenieść 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V do inkubatora i inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 .
- Po inkubacji przez 1 godzinę wyjąć z inkubatora 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V i odwirować przy ~1,200 x g przez 5 minut. Po odwirowaniu zdekantować pożywkę z dołków, obracając płytkę do góry nogami do pojemnika zawierającego 10% wybielacza.
- Umyj komórki w każdym dołku, umieszczając je ponownie w 125 μl ciepłego RPMI-10, dokładnie wymieszaj pipetą i odwiruj płytkę przy ~1,200 x g przez 5 minut. Zdekantuj pożywkę, obracając płytkę do góry nogami do pojemnika zawierającego 10% wybielacza. Powtórz ten krok prania dwa razy.
- Po umyciu dodać 100 μl ciepłego RPMI-10 do każdej studzienki, wymieszać w górę i w dół pipetą i inkubować płytkę przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w obecności 5%CO2.
2. Dzień 3
- Wyjąć z inkubatora 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery V zawierającą 100 μl komórek i pożywki/basenika i przenieść ją do komory bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszaj zawartość każdego dołka i przenieś komórki i pożywkę na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U lub wstępnie oznakowane probówki polipropylenowe o pojemności 5 ml.
- Przepłukać każdą studzienkę w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V 100 μl 1% paraformaldehydu (PFA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i przenieść do odpowiednich dołków w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U lub oznakowanych probówkach polipropylenowych o pojemności 5 ml z kroku 2.1, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5% PFA / studzienkę lub probówkę. Dokładnie wymieszaj za pomocą pipety wielokanałowej, przykryj płytkę folią aluminiową i pozostaw w inkubatorze na 30 minut, aby utrwalić komórki.
- Przygotuj cytometr przepływowy (patrz na przykład tabela materiałów), uruchamiając niebarwione komórki K562, aby skalibrować rozproszenie boczne i przednie wraz z ustawieniami fluorescencji. Jedynym wymaganym kanałem fluorescencji jest FL1, ponieważ GFP jest jedyną fluorescencją emitowaną przez komórki. Zdobądź ~30 000–50 000 komórek z każdej próbki.
nuta: Do pozyskiwania danych można użyć dowolnego cytometru przepływowego zdolnego do odczytu pojedynczej fluorescencji, ponieważ komórki zakażone RVP będą emitować tylko zieloną fluorescencję ze względu na obecność GFP i nie są potrzebne żadne inne kanały fluorescencyjne.
3. Analiza danych
- Analizuj dane uzyskane na cytometrze przepływowym za pomocą dowolnego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów).
- Ustaw pierwszą bramkę na podstawie FSC-A (rozproszenie do przodu – obszar) vs FSC-H (rozproszenie do przodu – wysokość), aby uwzględnić pojedyncze komórki i wykluczyć autofluorescencyjne dublety z analizy. Następnie bramkowane komórki bramkowane singletowo oparte na SSC-A (rozproszenie boczne – obszar) vs FSC-A, aby wykluczyć wszelkie zanieczyszczenia autofluorescencyjne.
- Analizuj komórki bramkowane SSC-A i FSC-A pod kątem ekspresji GFP na podstawie SSC-A vs GFP-A. Określ procentową zawartość komórek GFP+ dla każdego rozcieńczenia surowicy i próbek kontrolnych, ustawiając bramkę wokół komórek GFP+.
- Określić średni procent komórek GFP+ dla każdej studzienki rozcieńczenia i kontrolnej próbki surowicy, dzieląc całkowity procent komórek GFP+ w studzienkach potrójnych przez 3.
- Oblicz krotne zwiększenie infekcji, dzieląc średni procent komórek GFP+ w próbkach surowicy dla każdego rozcieńczenia przez średni procent komórek GFP+ w RPMI-10 z dołkami kontrolnymi RVP (bez próbki surowicy).
- Zwiększ zwiększenie fałdu na wykresie (oś y) w porównaniu z rozcieńczeniem (oś x) i wykonaj analizę statystyczną przy użyciu ANOVA, a następnie testu post-hoc Tukeya w celu wielokrotnych porównań.
