Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie zapasów i magazynowanie CFSE
- Przygotować 5 mM zapasu estru sukcynimidylowego dioctanu 5- i 6-karboksyfluoresceiny (CFSE) w dimetylosulfotlenku. Wir. Dozować 100 μl porcji do sterylnych mikroprobówek z nakrętką o pojemności 0,5 ml. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
2. Myszy
- Używaj wsobnych samców lub samic myszy w wieku od 8 do 12 tygodni. Preferowane są zwierzęta dopasowane pod względem płci i wieku. Upewnij się, że niezbędne pozwolenia etyczne dla zwierząt są na miejscu przed rozpoczęciem eksperymentów.
3. Unieruchomienie zwierząt za pomocą znieczulenia gazem izofluranu
- Załadować jednostkę anestezjologiczną izofluranem. Napełnić strzykawkę ze szkła gazoszczelnego o pojemności 10 ml izofluranem. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza. Połącz strzykawkę i wlot płynu z dołączoną rurką i przesuwaj popychacz do przodu, aż płyn w rurce łączącej będzie widocznie gotowy do wejścia do waporyzatora.
nuta: Nie przechowywać izofluranu w strzykawce, gdy nie jest używany.
- Znieczulać zwierzęta izofluranem w komorze indukcyjnej, przy przepływie powietrza utrzymywanym na poziomie około 400 - 500 ml/min i stężeniu izofluranu na poziomie 3,5%.
nuta: Urządzenie nie będzie działać bez przepływu powietrza.
- Gdy zwierzęta zasną, przekręć kran na jednostce anestezjologicznej, aby skierować gaz izofluran do części maski. Sprawdź, czy element maski jest nienaruszony, aby uniknąć wycieku gazu. Przepływ powietrza może być utrzymywany na poziomie 400 ml/min, alternatywnie zmniejszany do 200 ml/min. Zmniejszyć stężenie izofluranu do 2,6%.
nuta: Efekt znieczulenia można zwiększyć i/lub zmniejszyć, dostosowując natężenie przepływu.
4. Zastrzyki BCG i rekonwalescencja
- Potwierdź wizualnie i wykonaj testy, takie jak test odruchu szczypania palców u stóp, aby upewnić się, że myszy są unieruchomione/śpią na masce izofrubranowej przed wykonaniem zastrzyków.
- Zaszczepić w tylnej opuszki łapy, 1 x 106 Jednostki tworzące kolonie Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) w 30 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą strzykawki wyposażonej w igłę 29 G x 1/2 cala.
nuta: Wytwarzanie stad prątków jest pokrótce opisane w pierwotnym opisie tej procedury oraz w bardzo szczegółowym miejscu w innym miejscu. BCG jest również łatwo dostępny ze źródeł komercyjnych. Autorzy zalecają, aby BCG był poddawany sonikowi impulsowemu lub przepuszczany przez strzykawkę w celu rozbicia grudek przed jego zaszczepieniem myszom. BCG jest tutaj powtarzany jako bodziec mikrobiologiczny, biorąc pod uwagę jego zastosowanie w pierwotnym opisie tego protokołu 3, ale autorzy z pewnością zachęcają do testowania innych bodźców mikrobiologicznych.
- Wykonaj tę samą procedurę, którą opisano powyżej, dla wstrzyknięcia PBS myszom kontrolnym.
- Należy monitorować zwierzęta po wstrzyknięciu, aby potwierdzić, że rekonwalescencja po znieczuleniu przebiega pomyślnie i że zwierzęta mogą podeprzeć się na wstrzykniętej tylnej opuszki stopy.
5. Zastrzyki CFSE
- Przygotowanie CFSE do wstrzyknięć
- Rozmrozić fiolkę z 5 mM roztworem podstawowym CFSE w temperaturze od -80 °C. Rozcieńczyć CFSE 10-krotnie w PBS. Roztwór należy dokładnie zawiesić przed napełnieniem strzykawki w celu przygotowania do wstrzyknięcia.
- Wstrzykiwanie i odzyskiwanie CFSE
- Powtórz procedurę znieczulania zwierząt opisaną w sekcji 3. Wstrzyknąć 20 μl 0,5 mM CFSE w tylną opuszkę stopy, która wcześniej otrzymała BCG lub PBS.
nuta: Wstrzyknięcie CFSE powinno być wykonane dzień przed (24 godziny) planowaną datą uśmiercenia.
6. Chirurgiczne usunięcie węzła chłonnego podkolanowego (pLN)
UWAGA: Na tym etapie zachęca się do używania wysterylizowanych narzędzi chirurgicznych i ich wielokrotnego odkażania 70% etanolem.
- Poddaj myszy eutanazji. Spryskaj zwierzę 70% etanolem. Przygwoźdź zwierzę w pozycji grzbietowej, na desce do sekcji.
nuta: Autorzy mogą zalecić eutanazję poprzez zwichnięcie szyjki macicy.
- Ostrożnie wykonaj pionowe nacięcie w tylnej części uda. Oczyść mięśnie i tłuszcz za pomocą nożyczek i pęsety, aby odsłonić, a następnie wyciąć pLN znajdujący się głęboko w woreczku tłuszczowym, w zagłębieniu kolana.
- Przenieść pLN do 0,5 ml sterylnego PBS na lodzie.
7. Generowanie zawiesiny jednokomórkowej z pLN
- Homogenizować pLN przez sitko komórkowe o średnicy 70 mikronów umieszczone na płytce 6-dołkowej zawierającej 5 ml PBS lub buforu do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) (PBS zawierający 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 1 mM azydku sodu). Homogenizować przez sitko za pomocą tylnej części strzykawki o pojemności 3 ml.
nuta: Azydek sodu jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
- Przemyć sitko kolejnymi 5 ml buforu PBS lub FACS, zebrać materiał do probówki o pojemności 15 ml i zagnieździć komórki pod ciśnieniem 277 x g (1 200 obr./min, R = 172 mm) przez 5 minut, 4 °C. Alternatywnie, homogenizować pLN bezpośrednio w probówkach do mikrowirówek za pomocą homogenizatorów polipropylenowych.
- W zależności od wielkości osadu, zawiesić zawiesinę pLN w odpowiedniej objętości buforu PBS lub FACS, np. 200 - 1 000 μl. Użyj komory zliczającej, aby określić ilościowo całkowitą liczbę komórek uzyskaną z każdej zawiesiny LN. Użyj błękitu trypanowego, aby wykluczyć martwe/umierające komórki.
8. Barwienie komórek i cytometria przepływowa
- Przenieś 1 - 10 x 106 komórek do 5 ml okrągłodennych probówek polistyrenowych. Przemyć buforem FACS i osadem przez odwirowanie przy 277 x g (1 200 obr./min, R= 172 mm) przez 5 min, 4 °C.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 - 100 μl koktajlu przeciwciał (patrz markery komórek dendrytycznych [DC] używane do barwienia powierzchni, tabela materiałów) zawierającego 0,5 - 1 μg anty-mysiego CD16 / CD32 (w celu zablokowania niespecyficznych oddziaływań, w których pośredniczy Fc) w buforze FACS przez 30 - 45 minut, na lodzie. Chronić próbki przed światłem.
- Po inkubacji przepłukać komórki buforem FACS i osadem przez odwirowanie przy 277 x g (1 200 obr./min, R = 172 mm) przez 5 minut, 4 °C.
- Zawieś komórki w 50 - 100 μl buforu FACS. Pozyskaj dane na cytometrze przepływowym.
