Test do ilościowego oznaczania cytozolowej i wakuolarnej salmonelli w zakażonych pierwotnych makrofagach

Streszczenie

Źródło: Meunier, E., et al. Kwantyfikacja cytozolowej i wakuolarnej salmonelli w pierwotnych makrofagach przez różnicową przepuszczalność. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film demonstruje test do ilościowego oznaczania cytozolowego i wakuolarnego Salmonella typhimurium wewnątrz makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą różnicowej przepuszczalności. Makrofagi są zakażone Salmonellą wykazującą ekspresję białka fluorescencyjnego, która jest internalizowana w wyspecjalizowanej strukturze wakuolarnej zwanej wakuolą zawierającą Salmonellę lub SCV. Podzbiór bakterii ucieka z SCV i dostaje się do cytozolu. Bogata w cholesterol błona plazmatyczna makrofagów jest przepuszczalna za pomocą digitoniny, pozostawiając SCV nienaruszony. Po znakowaniu bakterii cytozolowych fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem, procent bakterii wakuolarnych i cytozolowych określa się ilościowo za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).

Protokół

1. Test digitoniny z ekspresją mCherry Salmonelli (analiza oparta na FACS)

1. Przygotowanie bakterii
   Uwaga: W tym teście stosuje się Salmonellę typu dzikiego SL1344 (oporną na streptomycynę) wykazującą ekspresję mCherry z plazmidu (pFPV kodującego mCherry pod promotorem rpsM). Fagocytoza i proliferacja bakterii nie uległy zmianie przez konstytutywną ekspresję mCherry (dane nie pokazane).
   1. Zaszczepić szczep 1 dzień przed zakażeniem w 3 ml pożywki LB uzupełnionej streptomycyną (90 μg/ml) i ampicyliną (100 μg/ml, wektor wykazujący ekspresję mCherry) w wytrząsarce w temperaturze 37 °C O/N.
2. Posiewanie komórek do infekcji.
   1. Wysiewaj BMDM typu dzikiego na 24-dołkowej płytce o gęstości 1,25 x 10⁵ komórek/basenik w 1 ml pierwszorzędowej pożywki makrofagowej (DMEM uzupełniony 10% surowicą cielęcą płodu (FCS, inaktywowaną termicznie, 56 °C, 30 min), 1% kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 1% aminokwasów endogennych (NEAA), 1% L-glutaminy i 10% supernatantu L929 (kondycjonowane podłoże z czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) wytwarzającego komórki L929). Studzienki nasienne zgodnie z tabelą 1 uwzględniają indywidualne warunki. Dodać szkiełka nakrywkowe do studzienek używanych jako kontrole (tabela 1).
   2. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
3. Przygotowanie bakterii do infekcji.
   1. Następnego dnia oznacz stężenie Salmonelli w nocnej hodowli, rozcieńczając kulturę w stosunku 1:10 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i mierząc OD₆₀₀ w porównaniu z kontrolą zawierającą tylko PBS. Gwarantuje to, że OD₆₀₀ jest mierzony w zakresie liniowym spektrofotometru.
   2. Obliczyć stężenie Salmonelli na ml. OD₆₀₀ równe 1 odpowiada bakteriom 1 x 10⁹.
   3. Rozcieńczyć bakterie w pożywce makrofagowej, aby osiągnąć stężenie Salmonelli 1,25 x 10⁶ komórek/ml.
4. Zakażenie komórek Salmonellą.
   1. Usunąć pożywkę z BMDM. Dodać 1 ml pożywki makrofagowej do niezakażonych studzienek kontrolnych (B1-B3, C1-C3). Dodać 1 ml zawiesiny Salmonelli do studzienek A1 - A5, aby osiągnąć wielokrotność infekcji (m.o.i.) wynoszącą 10 bakterii na komórkę.
   2. Odwirować płytkę przez 15 minut w sile 300 x g w temperaturze 37 °C w celu zsynchronizowania infekcji. Przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
5. Zabijanie zewnątrzkomórkowej Salmonelli za pomocą gentamycyny.
   1. Po 1 godzinie od zakażenia wyjąć płytkę z inkubatora i dodać 0,1 ml pożywki makrofagowej zawierającej 0,1 mg/ml gentamycyny w celu zabicia bakterii zewnątrzkomórkowych. Dodaj gentamycynę do wszystkich studzienek, nawet do niezakażonych komórek kontrolnych, aby upewnić się, że wszystkie komórki są traktowane w ten sam sposób. Przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
6. Mycie komórek.
   1. Po 2 godzinach od zakażenia wyjąć płytkę z inkubatora i umyć wszystkie studzienki 2x 1 ml zwykłego DMEM (wstępnie podgrzanego do 37 °C) i zastąpić go pożywką makrofagową (wstępnie podgrzaną do 37 °C) zawierającą 10 μg/ml gentamycyny, aby zapobiec rozwojowi pozostałych bakterii zewnątrzkomórkowych. Przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
7. Przygotowanie świeżych z detergentami i przeciwciałami.
   1. Tuż przed pożądanym punktem analizy należy przygotować świeży roztwór podstawowy digitoniny o stężeniu 1 mg/ml w buforze KHM (110 mM octan potasu, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl₂, pH 7,3). Przefiltrować materiał podstawowy i rozcieńczyć w buforze KHM do stężenia roboczego 50 μg/ml digitoniny. Ponadto przygotować roztwór 0,1% saponiny w buforze KHM, przeciwciało anty-Salmonella sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (CSA-1-FITC) w stosunku 1/500, anty-kalneksyną w stosunku 1/100 lub izomerazą dwusiarczkową przeciwbiałkową (anty-PDI) w stosunku 1/100 w buforze KHM uzupełnionym 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).
8. Przenikanie komórek.
   1. Wyjąć płytkę z inkubatora i przemyć studzienki 3x 0,5 ml buforu KHM (podgrzanego do temperatury 37 °C). Usunąć bufor KHM i dodać 0,25 ml zwykłego buforu KHM do studzienek A4 i B1 / C1, bufor KHM z digitoniną do dołków A1 - A3 i B2 / C2 lub bufor KHM z saponiną do studzienek A5 i B3 / C3 (zgodnie z tabelą 1). Inkubować dokładnie przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i natychmiast przemyć wszystkie studzienki 3x 0,5 ml buforu KHM (wstępnie podgrzanego do 37 °C).
9. Barwienie przeciwciał pierwotnych.
   1. Usunąć bufor KHM i dodać pierwszorzędowe roztwory przeciwciał (Goat anti-Salmonella-FITC, 250 μl/basenik, 0,1 μg/ml) do odpowiednich studzienek (ryc. 1, tabela 1). Inkubować płytkę przez 15 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   2. Umyj komórki 1x 1 ml PBS.
10. Zainfekowane komórki (studzienki A1 - A5): analiza FACS
    1. Umyj komórki 3x PBS i dodaj 0,5 ml lodowatego PBS zawierającego 0,1% Tritonu. Przenieść do probówki FACS o pojemności 5 ml z nakrętką z sitkiem do komórek, aby rozbić agregaty komórkowe. Próbki należy przechowywać na lodzie.
    2. Przeanalizuj próbki FACS. Korzystając z w pełni przepuszczalnych elementów sterujących, ustaw bramkę dla wszystkich bakterii w oparciu o rozproszenie do przodu i z boku (FSC/SSC) w pierwszej kolejności, a następnie sygnał mCherry (filtr 610 nm ± 20 nm).
    3. Następnie przeanalizuj sygnał FITC w całej populacji bakterii przy użyciu w pełni przepuszczalnych i nieprzepuszczalnych kontroli, aby ustawić bramki dla bakterii cytozolowych (FITC+, mCherry+) i bakterii wakuolarnych (FITC-, mCherry+) (Figura 2).
    4. Po ustawieniu bramek przeanalizuj próbki i określ procentową zawartość bakterii cytozolowych w porównaniu z wakuolarnymi za pomocą oprogramowania FlowJo zgodnie z protokołem producenta.

Tabela 1: Schemat posiewu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) w formacie 24-dołkowym dla późniejszego zakażenia Salmonellą, przepuszczalności i barwienia.

		Przepuszczalność		Barwienie
	Szkiełko nakrywkowe szklane	Salmonella	Digitonina	Saponina	przeciw Salmonelli	anty-Calnexin	anty-PDI
A1 (próbka)	-/+*	+	+		+
A2 (próbka)	-/+*	+	+		+
A3 (próbka)	-/+*	+	+		+
A4 (brak kontroli przepuszczalności)	-/+*	+			+
A5 (pełna kontrola przepuszczalności)	-/+*	+		+	+
B1 (barwione na obecność kalneksyny)	+					+
B2 (barwiony na obecność kalneksyny)	+		+			+
B3 (barwione na obecność kalneksyny)	+			+		+
C1 (barwiony na PDI)	+						+
C2 (barwiony na PDI)	+		+				+
C3 (barwiony na PDI)	+			+			+

Wyniki

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie protokołu 1. Zakażone komórki zawierające mCherry-dodatnią Salmonellę w nienaruszonych wakuolach lub cytozolu są różnie przepuszczalne z digitoniną. Cytozolowa Salmonella jest barwiona anty-Salmonellą sprzężoną z FITC. Komórki są myte i poddawane lizie za pomocą Triton X-100 w celu analizy FACS. Komórki kontroli ujemnej nie są przepus...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Digitonina	Sigma	Zobacz materiał D5628	50ug/ml
PFA (Biuro Ochrony Środowiska	Protokół mpbio	219998380
HEPESY	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 15630
Octan potasu	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	Zobacz materiał M8266
Bsa	Sigma	Certyfikat A2153
anty-Salmonella CSA-1-FITC	KPL (Polskie Biuro	01-91-99-MG	1/500
anty-Salmonella CSA-1	KPL (Polskie Biuro	02-91-99-MG	1/500
anty-Calnexin	Enzo Nauki Przyrodnicze	SPA-860D	1/100
anty-PDI	Enzo Nauki Przyrodnicze	Zobacz materiał SPA-890	1/100
Saponina	Sigma	Numer katalogowy: 47036
Medium montażowe Vectashield	Laboratoria wektorowe	H-1200
Przeciwciało anty królika-488	Sondy molekularne	A-11070	1/500
Gentamycyna	Technologie życiowe	Rocznik 15710-49	100ug/ml i 10ug/ml
Tryton X-100	Preparat Promega	Zobacz materiał H5141
Pbs	Gibco (firma Gibco)	20012-019
DMEM (DMEM)	Sigma	Zobacz materiał D6429
NEAA (Agencja Zdrowia)	Amimed (Amimed)	5-13K00-H
FACS Fortessa	Technologie BD		detekcja mCherry 610 nm
FACS Fortessa	Technologie BD		detekcja FITC 530 nm

Prasowe szt. Prasowe szt. szt.