Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Przygotowanie buforu do pobrania krwi ludzkiej i izolacji przemytych płytek krwi
- Przygotować 100 ml wodnego roztworu kwasu cytrynianu i dekstrozy (ACD), rozpuszczając 1,4 g monohydratu kwasu cytrynowego (C, 6, H, 8O,7•H2O, 66,6 mM), 2,5 g dwuwodnego cytrynianu trisodowego (Na3C6H5O7•2 H2O, 85 mM) i 2 g bezwodnej D(+)-glukozy. pH roztworu wynosi około 4,5.
- Przygotować roztwory podstawowe dla bufora Tyrode'a w następujący sposób
- Przygotować roztwór podstawowy 1, rozpuszczając 80 g chlorku sodu (NaCl), 2 g chlorku potasu (KCl), 10 g wodorowęglanu sodu (NaHCO3) i 0,58 g diwodorofosforanu sodu jednowodnego (NaH2PO4 * H2O) w 500 ml destylowanego H2O. Odpowiednie stężenia końcowe wynoszą 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM i 8,4 mM. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przygotować roztwór podstawowy 2, rozpuszczając 10,15 g sześciowodnego dichlorku magnezu (MgCl2*6 H2O) (100 mM) w 500 ml wody destylowanej (H2O). Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przygotować roztwór podstawowy 3, rozpuszczając 10,95 g (100 mM) sześciowodnego chlorku wapnia CaCl2*6H2O w 500 ml destylowanegoH2O. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przygotować bufor Tyrode'a, rozcieńczając 2,5 ml roztworu podstawowego 1 w końcowej objętości 50 ml destylowanymH2O. Odpowiada to stężeniom końcowym 136,5 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 11,9 mM NaHCO3 i 0,42 mM NaH2PO4*H2O. Dostosuj pH do 7,35 i sterylizuj przez filtrowanie filtrami 0,22 μm.
- Przygotować 0,35% bufor albuminy Tyrode'a (bufor TA) przez rozcieńczenie 5 ml roztworu podstawowego 1, 1 ml roztworu podstawowego 2, 2 ml roztworu podstawowego 3, 0,5 ml 1M HEPES, 1,8 ml albuminy surowicy ludzkiej 200 g/l i 0,1 g bezwodnej D(+)-glukozy w końcowej objętości 100 ml destylowanegoH2O.
- Dostosować pH do 7,35 za pomocą 1N kwasu solnego (HCl) i ustawić osmolarność na 295 mOsm/L, dodając destylowanyH 2O (10% całkowitej objętości). Końcowe stężenia w tym roztworze to 124 mM NaCl, 2,44 mM KCl, 10,82 mM NaHCO3, 0,38 mM NaH2PO4*H2O, 0,91 mM MgCl2*6 H2O, 1,82 mM CaCl2*6 H2O. Utrzymuj bufor TA w temperaturze 37 °C podczas całego eksperymentu.
2. Pobieranie krwi
- Zebrać 45-50 ml krwi żylnej z żyły łokciowej za pomocą igły 19 G i bez opaski uciskowej lub z niską opaską uciskową do 50 ml probówek zawierających antykoagulant ACD (1 objętość ACD na 6 objętości krwi). Wyrzuć pierwsze 1-2 ml krwi, aby uniknąć obecności trombiny i czynnika tkankowego.
- Po pobraniu wymieszaj krew z ACD, delikatnie odwracając probówkę. Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
3. Przygotowanie ludzkich płukanych płytek krwi
- Podgrzej wirówkę do temperatury 37 °C. Wszystkie poniższe etapy wirowania są wykonywane w tej temperaturze.
- Pobraną krew należy przesłać do probówek o pojemności 15 ml (5 ml na probówkę) i odwirować przy 250 x g przez 13 minut, aby uzyskać osocze bogatopłytkowe, PRP.
nuta: Ten etap wirowania powoduje wytworzenie trzech warstw w próbce: 1) Górna warstwa, składająca się z osocza, płytek krwi i niewielkiej frakcji białych krwinek. 2) Warstwa pośrednia, porcja bogata w białe krwinki. 3) Dolna warstwa, która zasadniczo składa się z czerwonych krwinek.
- Pobrać PRP, ostrożnie pipetując górną warstwę do nowej probówki o pojemności 15 ml, aby maksymalnie zapobiec zanieczyszczeniu krwinkami czerwonymi i białymi, i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
- Odwirować PRP przy 2 200 x g przez 12 minut (dla 5 ml PRP).
nuta: Ten etap wirowania powinien być wykonywany z niskim hamulcem lub bez hamulca.
- Usunąć supernatant (osocze ubogie w płytki krwi) i ostrożnie ponownie zawiesić osad z 10 ml buforu TA zawierającego 2 μl/ml heparyny (5 000 U/ml) i 2,5 μl/ml 25 μM prostacykliny (ChOG2) za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
- Dodać 2,5 μl/ml 25 μM prostacykliny-I2 (PGI2) i wirować przez 8 minut przy 1 900 x g (z hamulcem dolnym lub bez hamulca).
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z 5 ml buforem TA zawierającym 2,5 μL/ml 25 μM PGI2 za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
- W okresie inkubacji odpipetować 150 μl zawiesiny płytek krwi do probówki o pojemności 1,5 ml i policzyć płytki krwi za pomocą automatycznego licznika komórek (który wykrywa wielkość krwinek poprzez pomiar zmian oporu prądu stałego).
- Po 10 minutach inkubacji dodać 2,5 μl/ml 25 μM ChOG2 do zawiesiny płytek krwi i natychmiast odwirować przy 1 900 x g przez 8 min.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad do stężenia 250 000 płytek krwi/μl z odpowiednią objętością buforu TA (tj. jeśli liczba komórek wynosi 500 000 na μl, zawiesić ponownie w 10 ml buforu TA) zawierającego 32 μl/ml apirazy w stężeniu 0,01 U/ml (stężenie końcowe 0,32 U/ml).
nuta: Wysokie stężenie apyrazy stosuje się w celu uniknięcia odczulania receptorów P2X purinoceptor 1, P2X1 indukowanego przez spontaniczne wydzielanie adenozynotrifosforanu (ATP) przy braku agonistów. Jest to ważne, ponieważ odpowiedzi wywołane kolagenem są indukowane przez szybką parakrynną/autokrynną aktywację P2X1 przez ATP uwalniane z aktywowanych płytek krwi. Jeśli szlak sygnałowy płytek krwi nie wymaga krytycznie zachowania funkcji P2X1, należy użyć apirazy 0,02 U/ml. Kilka badań wykazało, że 0,02 U/ml apyrazy pozwala uniknąć receptora adenozynodifosforanu ADP, purynoceptora P2Y i odczulania P2Y1 przy znikomych odpowiedziach P2X1.
- Inkubować zawiesinę komórek przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C przed wykonaniem pomiarów agregometrycznych. Preparat jest stabilny przez 5 do 8 godzin.
4. Agresgometria
- Przygotować fibrynogen (56 mg/ml) w buforze Tyrode'a.
- Odmierzyć pipetą 260 μl zawiesiny płytek krwi do szklanych kuwet (ryc. 1A; lewa kuweta) zawierających 10 μl fibrynogenu (56 mg/ml) i mieszadła magnetycznego, następnie inkubować zawiesinę przez 2-3 minuty w temperaturze 37 °C w studzienkach inkubacyjnych znajdujących się w agresjometrze (ryc. 1B i 1C).
- Wstępną inkubację z inhibitorem Panx1 Brilliant Blue FCF należy dodać 10 μl roztworu podstawowego o stężeniu 2,8 mM lub 28 mM (stężenie końcowe odpowiednio 100 μM i 1 mM) przez 7 minut w temperaturze 37 °C.
- Skalibruj agregometr do zakładanej wartości agregacji 100%, mierząc gęstość optyczną (OD) kuwety zawierającej 10 μl fibrynogenu (56 mg/ml), 10 μl błękitu brylantowego FCF (2,8 mM lub 28 mM) i buforu TA bez płytek krwi.
- Umieścić kuwetę w studzience agregacyjnej pod automatycznym mieszaniem i nacisnąć odpowiedni przycisk na klawiaturze komputera połączonego z agregiometrem (tj. nacisnąć F1, jeśli używana jest studzienka agregacji 1).
nuta: Ten opisany poniżej eksperyment obejmuje Brilliant Blue FCF. Związek używany do kalibracji musi być dostosowany do warunków doświadczalnych.
- Skalibruj agregometr do zakładanej wartości agregacji 0%, używając tej samej próbki płytek krwi, która zostanie użyta w eksperymencie przy automatycznym mieszaniu.
- Umieść kuwetę w studzience agregacji i naciśnij odpowiedni przycisk na klawiaturze komputera połączonego z agregiometrem. Odczekaj około 20-30 sekund, zanim przejdziesz dalej. To opóźnienie służy zapewnieniu, że przed dodaniem agonistów nie nastąpi agregacja.
nuta: Ponieważ każda różnica w liczbie płytek krwi może mieć wpływ na mierzoną średnicę zewnętrzną, krok kalibracji 0% należy powtórzyć dla każdego pojedynczego pomiaru.
- Dodać 20 μl pożądanego agonisty, takiego jak 15 μg/ml kolagenu (1 μg/ml końcowy) lub 1,125 mM kwasu arachidonowego (75 μM końcowy) do kuwety. Natychmiast rozpocznij nagrywanie przy ciągłym automatycznym mieszaniu, naciskając odpowiedni przycisk na klawiaturze komputera połączonego z aggregometer.
nuta: Dodanie agonisty indukuje aktywację płytek krwi. Agregaty płytek krwi można wyraźnie rozróżnić w szklanej kuwecie pod koniec eksperymentu (ryc. 1A; prawa kuweta).
- Nagrywanie zatrzymuje się automatycznie po 6 minutach. W tym momencie zapisz dane, klikając ikonę zapisywania na komputerze.
nuta: Obliczanie szybkości agregacji jest wykonywane przez komputer, który wyraża końcowe wyniki procesu agregacji w procentach.
