UWAGA: Upewnij się, że wszystkie procedury związane z hodowlą komórkową i infekcją wirusową są przeprowadzane w certyfikowanych kapturach bezpieczeństwa biologicznego, które są odpowiednie dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego przetwarzanych próbek. Do celów opisu protokołów, jako wirus modelowy stosuje się wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) znakowanego reporterowo Gaussia lucyferazy. W kontekście reprezentatywnych wyników, związki kwasu chebulagowego () i punikalagininy (PUG) są stosowane jako potencjalne leki przeciwwirusowe, które są ukierunkowane na interakcje glikoprotein wirusowych z glikozaminoglikanami na powierzchni komórki we wczesnych etapach wnikania wirusa. Heparyna, o której wiadomo, że przeszkadza w wnikaniu wielu wirusów, jest stosowana w takim kontekście jako leczenie kontroli pozytywnej. Aby uzyskać podstawowe informacje na temat technik wirusologicznych, namnażania się wirusów, oznaczania miana wirusa i ekspresji dawki zakaźnej w jednostkach tworzących blaszki (PFU), jednostkach tworzących ognisko (FFU) lub wielokrotności infekcji (MOI), czytelnik jest odsyłany do referencji. W celu zapoznania się z wcześniejszymi przykładami i zoptymalizowanymi warunkami stosowanymi dla wirusów pokazanych w reprezentatywnych wynikach, czytelnik jest odsyłany do referencji, a także do szczegółów wymienionych w Tabeli 1, Rysunek 1A.
1. Hodowla komórkowa, preparat złożony i cytotoksyczność związków
- Wyhoduj odpowiednią linię komórkową dla systemu infekcji wirusem, który ma być analizowany (Tabela 1). W przypadku HCV hoduj komórki Huh-7,5 w zmodyfikowanej pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 200 U/ml penicyliny G, 200 μg/ml streptomycyny i 0,5 μg/ml amfoterycyny B.
- Przygotować badane związki i kontrole, używając ich odpowiednich rozpuszczalników: na przykład rozpuścić i PUG w dimetylosulfotlenku (DMSO); przygotować heparynę w sterylnej, podwójnie destylowanej wodzie. Do wszystkich kolejnych rozcieńczeń należy użyć pożywek hodowlanych.
UWAGA: Końcowe stężenie DMSO w zabiegach z użyciem badanych związków jest mniejsze niż 1% w eksperymentach; 1% DMSO jest uwzględniony jako leczenie kontrolą ujemną w testach dla porównania.
- Oznaczyć cytotoksyczność badanych związków (np. i PUG) na komórkach pod kątem zakażenia wirusowego, stosując odczynnik określający żywotność komórek, taki jak XTT (2,3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo]-5-fenylo)-karbonylo]-2H-wodorotlenek tetrazolu):
- W przypadku HCV wysiewać komórki Huh-7,5 na 96-dołkowej płytce (1 ×10 4 komórki na studzienkę) i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze O/N o stężeniu 5% CO2 w celu uzyskania monowarstwy.
- Zastosować kontrolę DMSO (1%) lub zwiększające stężenia badanych związków i PUG (np. 0, 10, 50, 100 i 500 μM) do dołków hodowlanych w trzech egzemplarzach.
- Inkubować w temperaturze 37 °C przez 72 godziny, następnie wyrzucić pożywkę do płytki i dwukrotnie przemyć komórki 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Dodać 100 μl roztworu do oznaczania z zestawu do testów toksykologicznych in vitro na bazie XTT do każdego dołka i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez kolejne 3 godziny, aby umożliwić produkcję formazanu XTT.
- Oznaczyć absorbancję za pomocą czytnika mikropłytek przy badanej długości fali 492 nm i referencyjnej długości fali 690 nm.
- Obliczyć odsetek komórek, które przeżyły, stosując następujący wzór: żywotność komórek (%) = At / As × 100%, gdzie "At" i "As" odnoszą się odpowiednio do absorbancji badanych związków i kontroli rozpuszczalnika (np. 1% DMSO). Określić stężenie 50% cytotoksyczności komórkowej (CC50) badanych związków za pomocą oprogramowania analitycznego, takiego jak GraphPad Prism, zgodnie z protokołem producenta.
2. Odczyt infekcji wirusowej
UWAGA: Odczyt infekcji wirusowej zależy od używanego systemu wirusowego i może obejmować takie metody jak testy płytki nazębnej lub pomiar sygnałów reporterowych od wirusów oznaczonych jako reporter. Metoda wykrywania zakażenia reporter-HCV na podstawie aktywności reporterowej lucyferazy została opisana poniżej.
- Zebrać supernatanty z zainfekowanych studzienek i sklarować w temperaturze 17 000 x g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Zmieszać 20 μl testowego supernatantu z 50 μl substratu lucyferazy z zestawu do oznaczania lucyferazy Gaussia i bezpośrednio zmierzyć za pomocą luminometru zgodnie z instrukcjami producenta.
- Wyraź zakaźność HCV jako log10 względnych jednostek światła (RLU) w celu określenia zahamowania wirusa (%) i oblicz 50% skuteczne stężenie (EC50) badanych związków przeciwko zakażeniu HCV za pomocą algorytmów z oprogramowania GraphPad Prism zgodnie z protokołem producenta.
3. Test przyczepiania wirusa
UWAGA: Przykłady okresu inkubacji i dawki wirusa dla różnych wirusów są wymienione na rysunku 1A, 'Załącznik'. Wyższe stężenia wirusa można również badać poprzez zwiększenie MOI/PFU.
- Wysiewać komórki Huh-7,5 na 96-dołkowej płytce (1 ×10 4 komórki na studzienkę) i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 O/N w celu uzyskania monowarstwy.
- Wstępnie schłodzić monowarstwy komórek w płytkach w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
- Współtraktować komórki inokulum HCV (MOI = 0,01) i związkami testowymi lub kontrolnymi (końcowe stężenia to: = 50 μM; PUG = 50 μM; heparyna = 1 000 μg/ml; DMSO = 1%) w temperaturze 4 °C przez 3 godziny. Na przykład do inokulum wirusa o objętości 90 μl zawierającego 1 x 102 FFU dodać 10 μl roboczego rozcieńczenia o objętości 500 μM; daje to leczenie w końcowym stężeniu 50 μM i zakażenie HCV przy MOI = 0,01 na monowarstwie komórki.
UWAGA: Ważne jest, aby przeprowadzić doświadczenie w temperaturze 4 °C, ponieważ pozwala to na wiązanie wirusa, ale uniemożliwia jego przedostanie się, co najskuteczniej następuje w temperaturze 37 °C. Przeprowadzić dodawanie wirusa i związków testowych na lodzie, a następującą po tym inkubację w lodówce o temperaturze 4 °C, aby upewnić się, że temperatura jest utrzymywana na poziomie 4 °C.
- Usunąć supernatant i delikatnie przemyć monowarstwę komórek dwukrotnie 200 μl lodowatego PBS.
UWAGA: Wykonuj pranie delikatnie, aby uniknąć podnoszenia komórek.
- Nałożyć 100 μl podłoża podstawowego do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.
- Przeanalizuj wynikową infekcję, oznaczając supernatant pod kątem aktywności lucyferazy, jak opisano w "2. Odczyt infekcji wirusowej".
Tabela 1: Typ komórki gospodarza dla infekcji wirusowej.Wskazany jest typ komórek stosowany dla każdego systemu infekcji wirusowej opisanego w reprezentatywnych wynikach. Dodatkowe informacje na temat komórek można znaleźć w odwołaniu.
| wirus | Typ komórki |
| Wirus HCMV | Hel |
| Wirus HCV | Huh-7.5 |
| DENV-2 | Vero powiedział: |
| Mv | CHO-SLAM |
| Rsv | HEp-2 |
