Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Inokulacja myszy C57BL/6 komórkami nowotworowymi wykazującymi ekspresję T Ag
- Hodować linię komórkową włókniakomięsaka przekształconą w SV40 C57SV (lub podobną linię komórkową adherentną T Ag +) w zmodyfikowanej pożywce Eagle'a (DMEM) firmy Dulbecco z 4,5 g / L D-glukozy i L-glutaminą (1x) i uzupełnioną 1 mM pirogronianu sodu i 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w kolbach poddanych kulturze tkankowej w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 10% dwutlenku węgla (CO2).
- Gdy komórki staną się w pełni zlewające się lub lekko nadmiernie zlewające, delikatnie usuń i wyrzuć pożywkę, a następnie przepłucz monowarstwę wstępnie podgrzaną, sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
UWAGA: Maksymalna ekspresja T Ag jest osiągana, gdy komórki T Ag + osiągają 100% zgryźliwości.
- Wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego dodaj wstępnie podgrzany kwas trypsyna-etylenodiaminotetraoctowy (trypsyna-EDTA) (0,25%), aby pokryć monowarstwę w temperaturze pokojowej, aż komórki zostaną usunięte w łatach. Postukać kilkakrotnie w boki kolby hodowlanej, aby uwolnić pozostałe przylegające komórki.
UWAGA: W razie potrzeby i w celu przyspieszenia procesu trypsynizacji przenieść kolbę(-i) do inkubatora o temperaturze 37 °C. Usunięte komórki szybko przyjmą zaokrąglony kształt pod mikroskopem świetlnym. Ten krok powinien trwać około 5 minut.
- Dodać 5 ml pożywki DMEM i zdysocjować grudki, aby przygotować zawiesinę jednokomórkową, pipetując zawartość każdej kolby w górę iw dół.
- Przenieś zawiesinę komórek przez sitko komórkowe z porami 70 μm do probówki.
- Wirować probówkę o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić granulowane komórki w 10 ml sterylnego, zimnego PBS.
- Powtórz kroki 1.6 i 1.7 dwukrotnie.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru. Przygotować jednolitą zawiesinę zawierającą 4 x 10 7 komórek/ml sterylnego PBS.
- Wstrzyknąć 500 μl powyższej zawiesiny dootrzewnowo (i.p.) każdemu dorosłemu (6-12-tygodniowemu) samcowi lub samicy myszy C57BL/6.
2. Schematy leczenia
- Schemat leczenia w celu zbadania udziału komórek nTreg w immunodominacji TCD8
- Cztery dni przed zaszczepieniem in vivo myszy C57BL / 6 komórkami C57SV (krok 1.10), wstrzyknij każdemu zwierzęciu raz i.p. 0,5 mg przeciwciała monoklonalnego (mAb) anty-CD25 o niskiej zawartości endotoksyn (mAb) (klon PC-61.5.3), które zubaża komórki nTreg, lub z kontrolą izotypu IgG1 szczura (np. klon KLH / G1-2-2, klon HRPN lub klon TNP6A7).
- Schemat leczenia w celu zbadania znaczenia in vivo białek programowanej śmierci komórki (PD-1-PD-L1(2)) Interakcje w kształtowaniu dominacji immunologicznej TCD8
UWAGA: Zaangażowanie PD-1 przez PD-L1 często, ale nie zawsze, pośredniczy w koinhibicji i/lub wyczerpaniu TCD8 specyficznego dla Ag. Dlatego leczenie anty-PD-1 może być prowadzone równolegle z podawaniem przeciwciał anty-PD-L1 i anty-PD-L2, aby ujawnić dokładną interakcję międzykomórkową zaangażowaną w zjawisko biologiczne.
3. Przygotowanie docelowych splenocytów
- Eutanazja naiwnych myszy C57BL/6 (w wieku 6-12 tygodni), które będą służyć jako dawcy splenocytów przez zwichnięcie szyjki macicy.
- Umieść każdą mysz z brzuchem skierowanym do góry w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Spryskaj skórę 70% (v/v) etanolem, EtOH. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek podnieś skórę i wykonaj małe brzuszne nacięcie linii środkowej. Następnie przetnij skórę w kształcie krzyża, aby odsłonić otrzewną.
- Za pomocą kleszczy podciągnij otrzewną w sposób przypominający namiot, nie chwytając żadnego z narządów wewnętrznych. Rozetnij otrzewną, aby odsłonić jamę otrzewnej i delikatnie usuń śledzionę.
- Umieść śledzionę (śledziony) w 15 ml młynka do tkanek Dounce zawierającym 5 ml sterylnego PBS. Stosować ręczny nacisk za pomocą szklanego tłoka młynka, aż tkanka śledziony rozproszy się w czerwoną zawiesinę komórek jednorodnych.
UWAGA: W zależności od liczby zwierząt biorców w grupie doświadczalnej, do przygotowania komórek docelowych może być potrzebnych kilka śledziony myszy dawcy. W młynku o pojemności 15 ml można homogenizować do 3 śledzion.
- Przenieść homogenat do probówki o pojemności 15 ml. Wirować probówkę o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić supernatant. Zawiesić granulowane komórki w 4 ml buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK) na 4 minuty w celu wyeliminowania erytrocytów.
UWAGA: Jest to krok, w którym zależy od czasu. Nadmierna ekspozycja splenocytów na działanie buforu lizującego ACK zwiększy ich kruchość i sprawi, że będą podatne na niespecyficzną śmierć komórki.
- Do każdej probówki dodać 8 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) zawierającej 10% inaktywowanego termicznie FBS, L-alanylo-L-glutaminę, 0,1 mM minimalnych niezbędnych pożywek (MEM) aminokwasów endogennych, 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 1x penicyliny/streptomycyny, które będą dalej określane jako kompletna pożywka RPMI (Tabela materiałów).
- Przenieś zawartość przez pory 70 μm sitka komórkowego do nowej probówki o pojemności 15 ml.
- Wirować probówkę o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić granulowane komórki w 12 ml pełnego RPMI.
- Podziel zawiesinę splenocytów na 3 równe porcje (po 4 ml każda) w 3 oddzielnych probówkach.
4. Powlekanie docelowych splenocytów nieistotnymi i pokrewnymi peptydami
- Oznacz probówki zgodnie z peptydami, które będą używane do pulsowania docelowych splenocytów. Splenocyty kontrolne będą pulsowane nieistotnym peptydem, a każda populacja pokrewnych docelowych splenocytów będzie pulsowana syntetycznym peptydem odpowiadającym immunodominującemu epitopowi pochodzącemu z T Ag (miejsce IV) lub subdominującemu epitopowi T Ag (miejsce I lub miejsce II/III) (Tabela 1).
UWAGA: Wybór nieistotnych peptydów zależy od konfiguracji eksperymentalnej i szczepu myszy użytego w każdym badaniu. Autorzy często używają gB498-505 (epitop peptydu immunodominującego H-2Kb wirusa opryszczki pospolitej [HSV]-1) i / lub GP33-41 (epitop peptydu immunodominującego H-2Db z ograniczeniem limfocytarnego wirusa zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych ([LCMV]) u myszy C57BL / 6 (Tabela 1). Peptydy te są optymalnym wyborem, ponieważ: (i) pochodzą z patogenów, które nie zostały wcześniej napotkane w opisanym tutaj modelu mysim; (ii) podobnie jak peptydy pochodzące z T Ag, gB498-505 i GP33-41 są ograniczone i wiążą się z cząsteczkami H-2b. W testach uśmiercania in vivo z "trzema pikami" każdy z dwóch pików, które odpowiadają pokrewnym komórkom docelowym, może reprezentować splenocyty pulsowane peptydem immunodominującym lub subdominującym. Wybór każdego zestawu peptydów różni się w zależności od celów każdego eksperymentu. Patrz Rysunek 1 i Rysunek 2 jako przykłady takiej zmienności. W pozostałej części tego protokołu miejsca I i IV pochodzące z T Ag będą reprezentować odpowiednio peptydy subdominujące i immunodominujące.
- Pulsować zawartość każdej oznakowanej probówki 1 μM odpowiedniego peptydu przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Użyj oddzielnego sitka komórkowego (z porami 70 μm) dla każdej probówki, aby w razie potrzeby usunąć grudki i zanieczyszczenia.
- Wirować probówkę o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
- Ponownie zawiesić granulowane komórki w 12 ml sterylnego zimnego PBS i powtórzyć krok 4.4 jeszcze raz.
UWAGA: Ważne jest, aby usunąć jak najwięcej FBS, ponieważ FBS może związać ester sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE) w następnym kroku.
5. Znakowanie docelowych splenocytów za pomocą CFSE
- Ponownie zawiesić peptydowe pulsacyjne splenocyty w 4 ml sterylnego PBS.
- Dodaj CFSE w stężeniach 0,025 μM, 0,25 μM i 2 μM do probówek zawierających odpowiednio nieistotne peptydy, splenocyty pulsacyjne w miejscu I i IV.
UWAGA: Aby uzyskać jednolite oznakowanie CFSE, przytrzymaj każdą probówkę pod kątem 45° przed dodaniem CFSE z boku nieco powyżej zawiesiny komórek, a następnie natychmiast delikatnie wiruj. Zapewni to pojawienie się gładkich histogramów na końcu. Różnice w intensywności CFSE w zależności od partii i wieku nie są rzadkością. W związku z tym może być konieczne eksperymentowanie z różnymi dawkami CFSE przed podjęciem decyzji o optymalnych stężeniach, które należy zastosować.
ostrożność: CFSE jest toksyczny w stężeniach wyższych niż 5 μM.
- Umieścić probówki w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 15 minut i odwracać je raz na 5 minut.
- Dodaj 3 ml inaktywowanego termicznie FBS do każdej probówki, aby zatrzymać reakcję CFSE. Uzupełnij zawartość sterylnym PBS.
- Wirować probówkę o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
- Zawiesić granulowane komórki w 12 ml sterylnego PBS i powtórzyć krok 5.5.
6. Badanie odpowiedniego/równego oznakowania CFSE docelowych populacji splenocytów
- Zawiesić granulowane komórki w 3 ml PBS.
- Delikatnie wymieszaj rurki. Przenieść po 10 μl zawiesin komórek CFSEo niskiej zawartości CFSE(int) i zawiesiny wysokokomórkowej CFSE do 5 ml okrągłodennej probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją fluorescencji polistyrenu (FACS) zawierającej 200 μL PBS.
- Badaj komórki za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w laser o długości fali 488 nm. Narysuj bramkę limfocytów na podstawie właściwości rozpraszania do przodu (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC) komórek przed uzyskaniem 5000 zdarzeń wpadających w bramkę limfocytów w kanale FL-1.
- W "rodzicielskiej" populacji CFSE+ narysuj dodatkowe bramki histogramu, aby zidentyfikować subpopulacjeCFSE niskie,CFSE int iCFSE wysokie.
- Potwierdź równe lub prawie równe numery zdarzeń w trzech bramkach. Jeśli to konieczne, dostosuj liczbę komórek w probówkach "źródłowych" (krok 6.1) przed zmieszaniem i wstrzyknięciem docelowych splenocytów myszom naiwnym i przygotowanym do szczepienia w sekcji 7.
7. Wstrzykiwanie komórek docelowych znakowanych CFSE do naiwnych i zaszczepionych T-Ag biorców
- Delikatnie przekręć rurki źródłowe. Przenieś trzy zawiesiny komórek znakowane CFSE w równych proporcjach do nowej probówki.
- Uzupełnij zawartość sterylnym PBS.
- Wirować probówkę o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić granulowane komórki sterylnym PBS.
- Policz komórki w błękicie trypanowym za pomocą hemocytometru, aby zapewnić żywotność komórek na poziomie co najmniej 95%.
- Dostosuj objętość, aby wstrzyknąć 1 x 107 mieszanych komórek docelowych/200 μl PBS dożylnie (i.v), przez żyłę ogonową, do każdego biorcy myszy C57BL/6.
UWAGA: Przechowywać komórki na lodzie pomiędzy wstrzyknięciami. Przed każdym wstrzyknięciem należy delikatnie wymieszać komórki docelowe. Zapisz dokładny czas wstrzyknięcia dla każdej myszy, który określi, kiedy zwierzę będzie musiało zostać poddane eutanazji. Ważne jest, aby czas trwania cytotoksyczności in vivo był spójny dla wszystkich zwierząt biorących udział w tym samym doświadczeniu.
8. Akwizycja danych
- Dwie lub cztery godziny po wstrzyknięciu komórek docelowych znakowanych CFSE, należy poddać eutanazji myszy biorcy przez zwichnięcie szyjki macicy.
UWAGA: Czas trwania cytotoksyczności in vivo może się różnić w zależności od zastosowanego systemu doświadczalnego, immunogenności docelowych Ag, przewidywanej obfitości TCD8 specyficznego dla antygenu peptydowego w śledzionie oraz odporności ich funkcji litycznej między innymi.
- Usuń i przetrzyj każdą śledzionę osobno, jak w krokach 3.2−3.9.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w 3 ml PBS.
UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z tkanką śledziony i preparatami komórkowymi w temperaturze 4 °C lub na lodzie przed analizami cytofluorymetrycznymi. Ma to na celu zapobieżenie ciągłemu działaniu cytotoksyczności ex vivo.
- Przenieś około 1x107 komórek z każdej przetworzonej śledziony do czystej probówki FACS.
- Natychmiast badaj komórki za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w laser o długości fali 488 nm. Narysuj bramę limfocytów na podstawie właściwości komórek FSC i SSC.
- Zidentyfikuj splenocyty biorcy CFSE i komórki docelowe przeniesione CFSE+. Narysuj dodatkowe bramki mieszczące różne populacje komórek docelowych CFSEniskich,CFSE int i CFSEwysokich.
- Zdobądź łącznie 2000dołków CFSE w kanale FL-1.
9. Analiza danych
- Obliczyć specyficzną lizę każdej pokrewnej populacji komórek docelowych, korzystając z następującego wzoru:
% Specyficzna cytotoksyczność = 
gdzie x = liczba całkowita CFSE/wysoka liczba zdarzeń w myszy T Ag-primed, y =niska liczba zdarzenia CFSE w myszy T Ag-primed, a = liczba całkowita CFSE/wysoka liczba zdarzenia w myszy naiwnej, a b =niska liczba zdarzenia CFSE w myszy naiwnej.
nuta: W testach cytotoksyczności "trzech pików", w których ocenia się specyficzną lizę więcej niż jednej pokrewnej populacji docelowej, nie jest właściwe stosowanie częstości występowania komórek docelowych. Dzieje się tak po prostu dlatego, że na częstość występowania pokrewnej populacji komórek docelowych wpływa nie tylko odsetek nieistotnych kontroli, ale także odsetek innych pokrewnych docelowych splenocytów. W związku z tym numery zdarzeń w obrębie każdej bramki powinny być używane w powyższym wzorze, aby dokładnie obliczyć lizę każdej pokrewnej populacji komórek docelowych (komórek o wysokiej liczbie CFSE lubCFSE) w porównaniu zniskimi kontrolami CFSE.
Tabela 1. Peptydy wprowadzone w tym protokole.
powiedział:
powiedział:
| Źródło antygenu białkowego | Epitop peptydowy | oznaczenie | kolejność | Ograniczenie MHC I |
| SV401 Duży T Ag2 | T Ag206-215 | Teren I | SAINNYAQKL | H-2Db |
| SV40 Duży T Ag | T Ag223-231 | Teren II/III | CKGVNKEYL | H-2Db |
| SV40 Duży T Ag | T Ag404-411 | Teren IV | VVYDFLKC | H-2Kb |
| SV40 Duży T Ag | T Ag489-497 | Teren V | QGINNLDNL powiedział: | H-2Db |
| HSV-13 Glikoproteina B | gB498-505* | gB498-505 | SSIEFARL (Szpital) | H-2Kb |
| LCMV4 Glikoproteina | GP33-41* | Zobacz materiałGP 33-41 | KAVYNFATC powiedział: | H-2Db |
| 1Małpi wirus 40 | | | | |
| 2Antygen dużego guza | | | | |
| 3Wirus opryszczki pospolitej typu 1 | | | |
| 4Limfocytarny wirus zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych | | | |
| *używany jako nieistotny peptyd | | | |
