1. Przygotowanie odczynników
- Pożywka z soli żółciowych (BS): Aby przygotować bulion sojowy tryptyczny (TSB) zawierający 0,4% soli żółciowych (wagowo/objętościowo), należy ponownie zamieszać 200 mg soli żółciowych w 50 ml autoklawowanego TSB. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm. Zrób świeżą pożywkę co tydzień.
Notatki: Rutynowo stosowaną solą żółciową jest mieszanina cholanu sodu i deoksycholanu sodu w stosunku 1:1 wyizolowana z pęcherzyków żółciowych owiec i bydła. Jak wykazano wcześniej, obecność glukozy była niezbędna do tworzenia biofilmu indukowanego solami żółciowymi. TSB dodał glukozę w stosunku do bulionu Luria-Bertani (LB); a zatem był wystarczający do wywołania tworzenia biofilmu u Shigella i innych analizowanych patogenów jelitowych. W zależności od bakterii, które mają być analizowane, mogą być potrzebne różne stężenia glukozy lub różne wymagania dotyczące cukru.
- 0,5% w/v fioletu krystalicznego w wodzie: Rozpuść 2,5 g fioletu krystalicznego w 500 ml wody destylowanej. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm.
- Konkanawalina A (ConA) sprzężona z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC): Rozpuść zapas w 1x PBS. Rozcieńczyć skoncentrowany bulion 10 mg w 400 μl 1x PBS do końcowego stężenia 25 μg/ml i chronić przed światłem.
- PBS + Glukoza: Rozpuść 0,2 g glukozy w 10 ml 1x PBS (2% w/v glukozy końcowej). Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm. Przygotuj świeże w dniu użycia.
- PBS + sole żółciowe: Rozpuść 40 mg w 10 ml 1x PBS (0,4% w/v soli żółciowych końcowych). Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm. Przygotuj świeże w dniu użycia.
- PBS + glukoza i sole żółciowe: Rozpuścić 40 mg soli żółciowych i 0,2 g glukozy w 10 ml 1x PBS (0,4% w/v soli żółciowych i 2% w/v glukozy końcowej). Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm. Przygotuj świeże w dniu użycia.
- Przygotuj płytki agarowe LB.
- Wiązanie formaldehydu/aldehydu glutarowego: Dodaj 810 μl formaldehydu (37% roztwór podstawowy, 3% stężenie końcowe) i 125 μl aldehydu glutarowego (25% roztwór podstawowy, 0,25% stężenie końcowe) do 14 ml 1x PBS. Dokładnie wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C. Poprawka powinna być zimna, aby można było z niej korzystać.
ostrożność: Naprawa jest toksyczna i wymaga utylizacji odpadów niebezpiecznych.
- Roztwór do mocowania zapobiegającego blaknięciu: Użyj roztworu do mocowania zapobiegającego blaknięciu zawierającego barwnik 4,6-diamidino-2-fenyloindolowy (DAPI), aby zahamować fotowybielanie próbek mikroskopii immunofluorescencyjnej podczas fluorescencyjnego barwienia DNA bakterii.
2. Przygotowanie bakterii
- Hodować przez noc kultury szczepów bakteryjnych, które mają być testowane, zaszczepiając 3 ml TSB pojedynczą, dobrze izolowaną kolonią w sterylnej probówce hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 225 obr./min do inkubacji przez noc (16 - 24 h).
nuta: Szczepy powinny być ponownie wyjmowane z zamrażarek co 2 do 4 tygodni i utrzymywane na talerzach nie starszych niż 2 tygodnie.
3. EPS Wykrywanie matryc
UWAGA: Te uzupełniające testy kwantyfikują i wizualizują EPS. W obu przypadkach EPS jest wykrywany za pomocą lektyny do wiązania polisacharydów. Białko sprzężone fluorescencyjnie umożliwia kwantyfikację.
- Półilościowe wykrywanie EPS
- Ustaw dwie probówki o pojemności 1,5 ml. Etykieta z TSB lub TSB + BS.
- Dodaj 1 ml TSB lub TSB + BS do odpowiednich probówek.
- Zaszczepić probówki 20 μl nocnej kultury (rozcieńczenie 1:50).
- Na sterylnej, czarnej, płaskodennej, poddanej kulturze tkankowej 96-dołkowej płytce, dodaj 130 μl / basenik niezaszczepionej pożywki kontrolnej do trzech dołków, aby służyły jako ślepa kontrola. Ustawić trzy studzienki kontrolne dla każdego rodzaju badanego medium. Dodać 130 μl/studzienkę zaszczepionej kultury do studzienek i powtarzać, aż wszystkie warunki doświadczalne zostaną posiane w trzech egzemplarzach.
- Inkubować statycznie przez 4 - 24 godziny w temperaturze 37 °C.
- Przenieść pożywkę hodowlaną na przezroczystą 96-dołkową płytkę za pomocą pipety, najlepiej pipety wielokanałowej. Należy zachować ostrożność, aby zebrać całą pożywkę hodowlaną bez zakłócania pracy populacji przylegającej i/lub EPS znajdującego się na powierzchni tworzywa sztucznego. Uchylenie.
- Utrwalić czarną płytkę na 15 minut w temperaturze pokojowej za pomocą 200 μl/studzienkę formaldehydu/aldehydu glutarowego w 1x PBS.
- Podczas gdy populacja przylegająca się utrwala, oceń frakcję supernatantu z kroku 1.1.6. Za pomocą czytnika płytek zapisz OD600. Ustaw studzienki kontrolne jako "puste". Upewnij się, że pożywka kontrolna jest czysta i nie ma oznak zmętnienia. Jeśli zostanie wykryte jakiekolwiek zmętnienie, odrzuć eksperyment.
- Alternatywnie, cały test można przeprowadzić na czarnej, przezroczystej płycie dolnej. W takich okolicznościach można zarejestrować wartości OD600, a następnie odrzucić pożywkę hodowlaną przed przejściem do kroku 3.1.7. Wartości OD600 można wykorzystać do normalizacji danych w przypadku znacznych różnic w tempie wzrostu między szczepami bakterii.
- Usuń poprawkę i wyrzuć do odpadów niebezpiecznych.
- Delikatnie umyć studzienki dwukrotnie 200 μl/studzienkę sterylnego PBS. Wyjmij płuczkę PBS za pomocą przewodu próżniowego, delikatnie przechylając płytkę i powoli zasysając płyn do dolnej krawędzi studzienki.
- Dodać 150 μl/basenik 25 μg/mL ConA-FITC i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Delikatnie przemyć dwukrotnie 200 μl PBS.
- Dodaj 150 μl PBS do każdej studzienki. Zapisać fluorescencję przy długości fali 488 nm.
