1. Szczepienie grup funkcyjnych aminy na krążkach z papieru celulozowego
- Przygotuj jeden kawałek kwadratowego papieru o wymiarze 1 cm × 1 cm oraz 100 krążków papierowych wykonanych z papieru celulozowego klasy 1 o średnicy 6,0 mm (bibuła filtracyjna o średnim przepływie) za pomocą dziurkacza.
- Aby wyprowadzić grupy -NH2 na krążkach papierowych, należy zmieszać 1 ml 3-aminopropylotrimetoksysilanu (APS) i 10 ml acetonu w szklanej butelce o pojemności 50 ml w dygestorium. Dodać krążki papierowe do świeżo przygotowanej mieszaniny odczynników APS i inkubować przez 5 godzin z mieszaniem orbitalnym (200 obr./min) w temperaturze pokojowej.
ostrożność: Z APS i acetonem należy obchodzić się pod wyciągiem.
- Nadmiar roztworu zdekantować ze szklanej butelki o pojemności 50 ml do pojemnika na odpady organiczne.
- Dodać 10 ml acetonu do szklanej butelki, dobrze wymieszać i całkowicie zdekantować, aby usunąć wszelkie nieprzereagowane APS i inne zanieczyszczenia. Powtórz ten krok dwa razy.
- Rozłóż papierowe krążki na ręczniku papierowym i wstaw do piekarnika o temperaturze 110 °C na 3 godziny. Poczekaj, aż krążki papieru ostygną. Przechowywać krążki w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej.
- Użyj spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR), aby sprawdzić szczepienie grup aminowych na kwadratowym papierze celulozowym, jak opisano poniżej (rysunek 1A).
- Włącz komputer i otwórz przyrząd do spektroskopii FTIR.
- Otwórz oprogramowanie do spektroskopii FTIR.
- Przejdź do sekcji "Inicjalizacja → pomiaru". Prostokąty "BS: KBr", "Lampa: Podczerwień" i "Laser" zmienią kolor na zielony po zakończeniu inicjalizacji.
- Wybierz "Dane" poniżej prostokątów i wybierz "%Transmittance", "Happ-Genzel", "45", "4.0" i "Min: 400, Max: 4000" dla "Trybu pomiaru", "Apodyzacji", "Liczba skanów", "Rozdzielczość" i "Zakres (cm-1)".
- Kliknij "Zmierz".
- Wybierz "Plik danych" dla danych w tle. Zapisz komentarze.
- Kliknij "BKG", aby uzyskać linię bazową tła.
- Zamocuj kwadratowy papier na uchwycie na próbkę filmu.
- Wybierz opcję "Plik danych" dla przykładowych danych. Zapisz komentarze.
- Kliknij "Próbka", aby uzyskać widma dla próbki.
- Zamknij aplikację do spektroskopii FTIR i wyłącz komputer.
- Powtórz powyższe kroki (kroki od 1.1 do 1.6), aby przygotować funkcjonalizowany aminą kwadratowy papier celulozowy i krążki klasy nr 113 (bibuła filtracyjna o szybkim przepływie) i uzyskać widma FTIR dla kwadratowego papieru klasy nr 113 (rysunek 1B).
2. Papierowy test immunoenzymatyczny (ELISA) do wykrywania immunoglobuliny G (IgG)
- Dodać 5 ml 0,05% roztworu aldehydu glutarowego (przygotowanego w 50 mM buforze PBS, pH 7,4) do szklanej butelki o pojemności 20 ml. Zanurz w tym roztworze 15 funkcjonalizowanych aminami bibułowych krążków filtracyjnych o średnim przepływie i przechowuj przez 1 godzinę z wstrząsaniem w temperaturze pokojowej.
- Jednocześnie powtórz krok 2.1, aby przygotować kolejne 15 funkcjonalizowanych aldehydami krążków z bibuły filtracyjnej o szybkim przepływie.
ostrożność: Z aldehydem glutarowym należy obchodzić się w dygestorium.
- Aby usunąć nieprzereagowany aldehyd glutarowy z krążków papierowych, należy umieścić 15 krążków z bibuły filtracyjnej o średnim przepływie w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, a 15 krążków z bibuły filtracyjnej o szybkim przepływie w innej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodaj 5 ml wody DI do każdej probówki i potrząsaj probówkami przez 10 sekund. Usuń wodę, zasysając pipetą. Powtórz dwa razy, aby usunąć nieprzereagowany aldehyd glutarowy.
- Wysuszyć papierowe krążki w piekarniku o temperaturze 37 °C.
- Dodać 5 μl i 8 μl 0,025 mg/ml mysich przeciwciał przeciwko fragmentom IgG-Fc do każdego z krążków z bibuły filtracyjnej o średnim i szybkim przepływie odpowiednio i inkubować przez 20 minut.
- Dodać 10 μl 50 mM PBS (pH 7,4) do każdego krążka papierowego bez usuwania przeciwciał i inkubować przez 40 minut dla reakcji aldehydu aminowego.
- Umyj papierowe krążki 0,2 ml buforu do mycia na ręczniku papierowym. Powtórz pranie trzy razy.
- Wysuszyć papierowe krążki w suszarce w temperaturze 37 °C.
- Zablokować krążki papieru 15 μl buforu blokującego na 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj każdy krążek papierowy 0,2 ml buforu do mycia na ręczniku papierowym. Powtórz pranie trzy razy.
- Uruchom wzorce IgG.
- Załadować 10 μl różnych stężeń IgG (np. 0, 10, 125, 250 i 500 ng/ml w PBS) na każdy krążek w trzech egzemplarzach. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Umyj papierowe krążki 0,2 ml buforu do mycia na ręczniku papierowym. Powtórz pranie trzy razy.
- Załadować 10 μl przeciwciał przeciwko fragmentom IgG-Fc myszy sprzężonym z HRP (1:10 000, 10 mM PBS, pH 7,4) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Umyj papierowe krążki 0,2 ml buforu do mycia na ręczniku papierowym. Powtórz pranie trzy razy.
nuta: Nie jest konieczne usuwanie buforu myjącego, ponieważ obecność buforu nie ma wpływu na wyniki.
- Załaduj 10 μl mieszaniny TMB i nadtlenku wodoru na każdy krążek.
- Zrób zdjęcia wszystkich papierowych krążków za pomocą aparatu cyfrowego lub smartfona po 5 minutach inkubacji.
nuta: Na rysunku 2A "0" oznacza krążki papierowe poddane działaniu immobilizacji przeciwciał wychwytujących oraz roztwór przeciwciała-HRP/TMB bez surowicy IgG.
- Przeanalizuj intensywność każdego papierowego krążka na obrazie za pomocą obrazu J.
- Przekonwertuj obrazy zrobione w kroku 3.15 na format ".tif".
- Otwórz oprogramowanie "Image J".
- Przejdź do "Plik → Otwórz", wybierz obraz do analizy.
- Wybierz przycisk kształtu "Owal".
- Przejdź do "Typ → obrazu → 32-bitowy".
- Przejdź do opcji "Edytuj → odwróć".
- Przejdź do sekcji "Analizuj → mierz".
- Kopiowanie i analizowanie danych w arkuszu kalkulacyjnym.
