Analizy biofizyczne służące do badania właściwości mechanicznych interfazy jądra komórkowego: aplikacja odkształcenia podłoża i manipulacja mikroiłką

Podsumowanie

Przedstawiamy dwa niezależne narzędzia oparte na mikroskopii, służące do pomiaru indukowanych odkształceń jądra i cytoszkieletu w pojedynczych, żywych komórkach przylegających w odpowiedzi na globalne lub lokalne przyłożenie naprężenia. Techniki te są wykorzystywane do określenia sztywności jądra (tj. odkształcalności) oraz do badania wewnątrzkomórkowej transmisji sił pomiędzy jądrem a cytoszkieletem.

Streszczenie

W większości komórek eukariotycznych jądro jest największą organellą i jest zazwyczaj od 2 do 10 razy sztywniejsze niż otaczający je cytoškielet; w konsekwencji właściwości fizyczne jądra znacząco wpływają na ogólne zachowanie biomechaniczne komórek w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Na przykład w migrujących neutrofilach i naciekających komórkach nowotworowych sztywność jądra może stanowić główną przeszkodę podczas ekstrawasacji lub przechodzenia przez wąskie przestrzenie w tkankach.¹ Z drugiej strony, jądra komórek w tkankach aktywnych mechanicznie, takich jak mięśnie, wymagają wystarczającego wsparcia strukturalnego, aby wytrzymać powtarzający się stres mechaniczny. Co ważne, jądro jest ściśle zintegrowane z architekturą komórkową; jest ono fizycznie połączone z otaczającym je cytoškieletem, co jest kluczowym wymogiem dla wewnątrzkomórkowego ruchu i pozycjonowania jądra, na przykład w komórkach spolaryzowanych, jądrach synaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych lub w komórkach migrujących.² Nic dziwnego, że niedawno wykazano, iż mutacje w białkach otoczki jądrowej, takich jak lamine i nespryny, które odgrywają krytyczną rolę w określaniu sztywności jądra i sprzężenia jądro-cytoškieletowego, prowadzą do szeregu ludzkich chorób, w tym dystrofii mięśniowej Emerygo-Dreifussa, obręczowej dystrofii mięśniowej oraz rozstrzeniowej kardiomiopatii.³ Aby zbadać funkcję biofizyczną różnych białek otoczki jądrowej oraz wpływ specyficznych mutacji, opracowaliśmy metody eksperymentalne do badania właściwości fizycznych jądra w pojedynczych, żywych komórkach poddanych globalnemu lub lokalnemu zaburzeniu mechanicznemu. Pomiar indukowanych deformacji jądra w odpowiedzi na precyzyjnie zastosowane odkształcenie podłoża dostarcza ważnych informacji o odkształcalności jądra i pozwala na ilościowe porównanie różnych mutacji lub linii komórkowych z niedoborem specyficznych białek otoczki jądrowej. Lokalna aplikacja odkształcenia cytoškieletu za pomocą mikroiły jest stosowana jako uzupełnienie tego testu i może dostarczyć dodatkowych informacji o wewnątrzkomórkowym przenoszeniu sił między jądrem a cytoškieletem. Badanie mechaniki jądra w nienaruszonych żywych komórkach pozwala zachować normalną architekturę wewnątrzkomórkową i uniknąć potencjalnych artefaktów, które mogą pojawić się podczas pracy z izolowanymi jądrami. Ponadto aplikacja odkształcenia podłoża stanowi dobry model stresu fizjologicznego doświadczanego przez komórki w mięśniach lub innych tkankach (np. komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych poddane odkształceniu naczyniowemu). Wreszcie, choć narzędzia te zostały opracowane głównie do badania mechaniki jądra, mogą one być również stosowane do badania funkcji białek cytoškieletowych i sygnalizacji mechanotransdukcyjnej.

Protokół

1. Aplikacja szczepu substratu

Pomiar znormalizowanego odkształcenia jądra obejmuje przygotowanie płytek do odkształcania z przezroczystymi, elastycznymi membranami silikonowymi jako powierzchnią do hodowli komórek, wysianie komórek na płytki oraz akwizycję obrazów komórek przed, w trakcie i po zastosowaniu odkształcenia (jednoosiowego lub dwuosiowego).

Przygotowanie naczyń z membraną silikonową oraz adhezja komórek

1. Każda szalka do rozciągania składa się z wykonanej na zamówienie plastikowej szalki bez dna o średnicy 3" oraz plastikowego pierścienia O-ring do mocowania membrany silikonowej, która służy jako podłoże do hodowli komórek. Aby przygotować szalki do rozciągania, należy zaciisnąć kawałek membrany silikonowej o wymiarach 4" x 4" pomiędzy pierścieniem O-ring a szalką. Ostrożnie odciąć nadmiar membrany, wypłukać wodą dejonizowaną, a następnie poddać szalki do rozciągania autoklawowaniu.
2. Przed pokryciem membran silikonowych cząsteczkami macierzy zewnątrzkomórkowej (np. fibronektyną), należy zaznaczyć punkt odniesienia w dolnym środku membrany (po zewnętrznej stronie). Punkt ten pomoże zidentyfikować te same komórki podczas eksperymentów z rozciąganiem. (Opcjonalnie: w przypadku zastosowania rozciągania jednowymiarowego, wokół punktu odniesienia nakleja się dwa równoległe paski taśmy klejącej, aby ograniczyć deformację membrany w jednym wymiarze).
3. Aby zapewnić optymalną adhezję komórek, należy pokryć membrany silikonowe fibronektyną w stężeniu 3 μg/ml rozpuszczoną w 10 ml PBS lub dowolnymi odpowiednimi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej. Szalkę do rozciągania należy przykryć odwróconą polistyrenową szalką o średnicy 10 cm i inkubować szalki przez noc w temperaturze 4°C.
4. Następnego dnia membrany należy wypłukać raz roztworem soli fizjologicznej w PBS (Phosphate Buffered Saline), aby usunąć nadmiar białka. Szalkę należy wypełnić 10 ml pożywki wzrostowej (Dulbecco's Modified Eagles Medium (high glucose) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny/streptomycyny) i odstawić.
5. Embryonalne fibroblasty mysie poddaje się trypsynizacji przy użyciu 0,05% trypsyny i wysiewa w pożywce wzrostowej przy konfluencji około 30% na pokrytą membranę silikonową, a następnie inkubuje przez 24 – 48 godzin w standardowych warunkach hodowli.

Eksperymenty z naprężeniem podłoża

6. Przygotuj mikroskop do eksperymentów. Doświadczenia przeprowadza się na mikroskopie odwróconym z kamerą cyfrową przystosowaną do mikroskopii fluorescencyjnej, kontrastowej lub DIC, używając obiektywu 60x oraz odpowiedniego oprogramowania do akwizycji obrazu (np. IPLab lub Metamorph). Mikroskop prosty nie nadaje się do tej aplikacji. Urządzenie do rozciągania składa się z płyty podstawy pasującej do stolika mikroskopu, która podtrzymuje centralną cylindryczną płytę służącą do przykładania odkształcenia do środkowej sekcji membrany silikonowej, ruchomej płyty podtrzymującej naczynie do rozciągania, która może przesuwać się w górę i w dół na czterech prowadnikach, oraz płyty obciążeniowej o masie 5 lb w celu przyłożenia obciążenia.
7. Aby zwizualizować jądra komórkowe, inkubuj komórki w naczyniu do rozciągania z 1 μg/mL Hoechst 33342 przez 15 min w 37°C. Odessaj medium i zastąp je 15 ml pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej (pożywka DMEM (high glucose) bez czerwieni fenolowej z 25 mM Hepes, uzupełniona o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny). Wkręć naczynie do rozciągania do płyty uchwytu naczyń. Ostrożnie nałóż smar (Braycote 804 Vacuum Grease) na obwód dolnej części membrany silikonowej, aby zapewnić poślizg membrany wzdłuż centralnej płyty. Upewnij się, że środkowa sekcja membrany pozostała czysta.
8. Umieść płytę podstawy na stoliku mikroskopu. Ostrożnie zamontuj płytę uchwytu naczyń na płycie podstawy. Upewnij się, że w początkowej pozycji spoczynkowej membrana silikonowa naczynia do rozciągania luźno spoczywa na centralnej płycie.
9. Najpierw ustaw ostrość na spodzie membrany silikonowej i znajdź centralny czarny punkt referencyjny. Punkt ten będzie służył jako punkt startowy dla wszystkich akwizycji obrazów i pomoże w lokalizacji tych samych komórek podczas i po rozciąganiu. Używamy specjalnie napisanego programu do zautomatyzowanego obrazowania w celu zapisywania pozycji komórek i ich ponownego lokalizowania podczas eksperymentu, ale można to również osiągnąć ręcznie.
10. Zaczynając od punktu, dostosuj ostrość, aby zwizualizować komórki i górną powierzchnię membrany silikonowej. Zlokalizuj dobrze rozprzestrzenione komórki z centralnie położonymi jądrami i wykonaj obraz w kontraście fazowym oraz obraz fluorescencyjny barwienia jąder Hoechst. Obraz w kontraście fazowym powinien być ostry na obrys komórki i membranę silikonową, natomiast obrazy fluorescencyjne powinny być ostre na płaszczyźnie centralnej jądra.
11. Po wykonaniu obrazów 5 do 15 komórek, wróć do centralnego punktu. Powoli przyłóż obciążenie do naczynia do rozciągania, co spowoduje jednorodne przyłożenie odkształcenia w centrum naczynia. Maksymalne przyłożone odkształcenie podłoża jest ograniczone przez nylonowe dystanse umieszczone na pionowych prowadnikach.
12. Ustaw ostrość na spodzie membrany silikonowej i ponownie zlokalizuj punkt referencyjny. Zaczynając od punktu, odnajdź te same komórki i ponownie wykonaj obraz w kontraście fazowym oraz obraz fluorescencyjny komórek i jąder przy pełnym odkształceniu, starając się jak najdokładniej dopasować płaszczyzny ogniskowania do obrazów początkowych. Proces ten nie powinien przekraczać 10 min, aby uniknąć aktywnego przebudowywania i adaptacji komórki do odkształconego podłoża.
13. Po wykonaniu wszystkich odpowiadających sobie obrazów, przesuń stolik mikroskopu z powrotem do punktu startowego. Ostrożnie usuń obciążenie z płyty uchwytu naczyń i pozwól membranie silikonowej powrócić do stanu spoczynku. Jeśli jest to konieczne, delikatnie pchnij naczynie do rozciągania w górę, aż znajdzie się w pozycji początkowej. Następnie wykonaj obrazy w kontraście fazowym i fluorescencyjne komórek po rozciąganiu, zgodnie z opisem powyżej dla obrazów z rozciągania.

Analiza

14. Obrazy komórek oraz jądra komórkowych znakowanych fluorescencyjnie przed, w trakcie i po zastosowaniu odkształcenia są analizowane w celu obliczenia znormalizowanego odkształcenia jądra. W naszym laboratorium do analizy wykorzystujemy autorski skrypt MATLAB, jednak dostępne są również alternatywne rozwiązania. Analiza przeprowadzana jest w trzech etapach.
15. W pierwszym kroku, aby obliczyć przyłożone odkształcenie podłoża, pozycje od 3 do 6 punktów kontrolnych znajdujących się na membranie są ręcznie dopasowywane pomiędzy odpowiadającymi sobie obrazami przed, w trakcie i po odkształceniu. Program MATLAB oblicza następnie przyłożone odkształcenie membrany poprzez porównanie pozycji dopasowanych punktów kontrolnych między obrazami przed odkształceniem a obrazami w pełnym odkształceniu, a także odkształcenie resztkowe między obrazami przed i po odkształceniu. Jednocześnie punkty kontrolne służą do rejestracji par obrazów, co pomaga w wykryciu uszkodzonych lub odrywających się komórek (patrz Rycina 1).
16. W drugim kroku jądra są wybierane ręcznie przy użyciu osobnego programu MATLAB, który oblicza odkształcenie jądra dla każdego poszczególnego jądra komórkowego poprzez dopasowanie rozmiaru jądra lub markerów wewnątrzjądrowych pomiędzy odpowiadającymi sobie fluorescencyjnymi obrazami przed, w trakcie i po odkształceniu. Aby uwzględnić niewielkie różnice w przyłożonym odkształceniu membrany pomiędzy różnymi eksperymentami, wyniki wyrażamy jako Znormalizowane Odkształcenie Jądra, zdefiniowane jako stosunek indukowanego odkształcenia jądra do przyłożonego odkształcenia membrany, obliczany dla każdego jądra. Skrypty MATLAB są dostępne w laboratorium Lammerdinga na zapytanie.
17. Na koniec każde jądro jest weryfikowane, a pomiary z komórek, które odłączyły się lub zostały uszkodzone podczas nakładania odkształcenia, są wykluczane (Rycina 1).

2. Test manipulacji mikroigłami

Przygotowanie naczyń, komórek adherentnych i mikroił oraz mikroigieł

1. Inkubować szalki hodowlane z dnem szklanym o średnicy 35 mm z niskim stężeniem fibronektyny (0.5ug/ml) w zbuforowanym roztworze soli Hanksa (HBSS) lub dowolnymi odpowiednimi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej przez 2 godziny w temperaturze 37°C. Przemyć szalki HBSS dwa razy i dodać do szalki 2 ml pożywki wzrostowej przed przejściem do następnego kroku.
2. Fibroblasty embrionalne myszy poddać trypsynizacji przy użyciu 0,05% trypsyny i wysiać w 2 ml pożywki wzrostowej w zagęszczeniu 7.5 x 10⁴ komórek/ml na szalki z dnem szklanym pokryte fibronektyną. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze na noc. W przypadku innych typów komórek należy zoptymalizować ich liczbę, aby uzyskać pojedyncze, adherentne, niekonfluencyjne komórki.
3. Wytrawić mikroigły wykonane z kapilar borokrzemianowych do średnicy końcówki około 1 do 3 μm za pomocą komercyjnego wyciągacza do pipet (np. Sutter Instrument Company).

Eksperyment manipulacji mikroigłami

4. Następnego dnia inkubować komórki z barwnikiem mitochondrialnym MitoTracker (600 μM; Invitrogen) oraz barwnikiem jądrowym Hoechst 33342 (1 μg/mL) dodanymi do pożywki wzrostowej przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37°C.
5. Przemyć komórki raz w roztworze HBSS przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać do komórek pożywkę wzrostową bez czerwieni fenolowej w celu obrazowania.
6. Nabyć jeden obraz pojedynczej komórki bez wprowadzonej w cytoszkielet mikroiły w kontraście fazowym, jeden obraz fluorescencyjny barwienia Hoechst 33342 oraz jeden obraz fluorescencyjny barwienia mitochondrialnego, używając obiektywu 60x (0.70 N.A., Plan-Achromat) w mikroskopie odwróconym z cyfrową kamerą CCD.
7. Używając mikromanipulatora (np. InjectMan NI 2, Eppendorf), ostrożnie wprowadzić mikroiłę do cytoplazmy komórki w stałej odległości (zazwyczaj 5 μm) od obwodu jądra, a następnie wykonać jeden obraz w kontraście fazowym, jeden obraz fluorescencyjny barwienia Hoechst 33342 oraz jeden obraz fluorescencyjny barwienia mitochondrialnego. W tej aplikacji pomocne jest sterowanie mikromanipulatorem za pomocą komputera, np. Windows Hyperterminal, aby uzyskać powtarzalne procedury mikromanipulacyjne.
8. Przesunąć mikroiłę o określoną odległość (zazwyczaj 10 lub 20 μm) w kierunku obwodu komórki z prędkością 1 μm/sec, jednocześnie wykonując obrazy fluorescencyjne i w kontraście fazowym co 10 sekund. Gdy mikroiła przesuwa się na określoną odległość w stronę obwodu komórki. Przy wybranych parametrach, podczas przesuwania mikroiły na określoną odległość w stronę obwodu komórki, będzie to odpowiadać 2-3 klatkom w procesie manipulacji.
9. Na koniec wykonać dodatkowe obrazy po usunięciu mikroiły z cytoszkieletu.

Analiza

10. Mapy przemieszczeń są obliczane przy użyciu skryptu MATLAB napisanego na zamówienie, opartego na śledzeniu fluorescencyjnie znakowanych elementów jądra i cytoplazmy. (Skrypt MATLAB jest dostępny w laboratorium Lammerdinga na prośbę). Program wykorzystuje algorytm znormalizowanej korelacji wzajemnej pomiędzy małymi obszarami obrazu (o rozmiarach około 10 μm x 10 μm, rozmieszczonymi w odstępach 5 μm) w kolejnych klatkach obrazu. Dla centrum każdego obszaru przemieszczenia w kierunkach x i y są obliczane jako przesunięcie pomiędzy pierwotną lokalizacją a nowo zidentyfikowaną pozycją; są one wyświetlane jako wektory przemieszczenia oraz zapisywane jako wartości liczbowe. Na podstawie map przemieszczeń można obliczyć średnie przemieszczenia wewnątrz zdefiniowanych obszarów. Należy pamiętać, że przemieszczenia cytoszkieletu opierają się na kanale fluorescencji dla markerów cytoszkieletu (np. barwienie mitochondriów MitoTracker), natomiast przemieszczenia jądra są obliczane z kanału fluorescencji odpowiadającego sygnałowi Hoechst 33342. W naszej aplikacji rutynowo badamy następujące obszary: (i) odkształcenie cytoszkieletu w miejscu przyłożenia naprężenia, tj. w miejscu wprowadzenia mikroiły; (ii) odkształcenie jądra w obszarze wewnątrz jądra w kierunku miejsca przyłożenia naprężenia; (iii) odkształcenie jądra w obszarze jądra oddalonym od miejsca przyłożenia; oraz (iv) odkształcenie cytoszkieletu w obszarze cytoplazmatycznym po przeciwnej stronie jądra. Dodatkowo można bezpośrednio zmierzyć wydłużenie jądra z sekwencji obrazów w kontraście fazowym lub fluorescencji Hoechst 33342. W takim przypadku przyłożone odkształcenie jądra oblicza się, dzieląc wydłużenie jądra (ΔL = L – L₀) przez długość początkową, L₀, gdzie L to długość końcowa jądra po zastosowaniu naprężenia, a L₀ to początkowa długość jądra. W przypadku komórek z nienaruszoną łącznością jądrowo-cytoszkieletową jądro będzie wydłużać się w kierunku miejsca przyłożenia naprężenia. W przeciwieństwie do tego, w komórkach, w których łączność jądrowo-cytoszkieletowa jest zaburzona, tj. siły są przenoszone mniej efektywnie między cytoszkieletem a jądrem, oczekuje się, że jądro będzie wydłużać się znacznie mniej w kierunku miejsca przyłożenia naprężenia. Zatem zmniejszone odkształcenia jądra w odpowiedzi na przyłożenie naprężenia do cytoszkieletu sugerują (częściowe) rozprzężenie jądra i cytoszkieletu.

3. Reprezentatywne wyniki:

Aplikacja odkształcenia podłoża

Pozyskano obrazy przed, w trakcie i po przyłożeniu odkształcenia do fibroblastów embrionalnych myszy heterozygotycznych i homozygotycznych z niedoborem laminy A/C (Lmna^+/– oraz Lmna^–/–) oraz myszy typu dzikiego (Lmna^+/+), a następnie obliczono znormalizowane odkształcenie jądrowe dla każdej komórki. Po analizie jądra zostały zweryfikowane, a komórki, które uległy uszkodzeniu lub skurczyły się podczas przyłożenia odkształcenia, wykluczono z analizy. Rycina 1A przedstawia jądra trzech komórek poprawnych, natomiast Rycina 1B przedstawia komórki, które powinny zostać wykluczone z analizy. Dane dotyczące znormalizowanego odkształcenia jądrowego zgromadzono z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów (każdy zawierający pomiary z ~5–10 jąder) i porównano z innymi grupami komórek lub grupami traktowanymi za pomocą analizy statystycznej. Zwiększone znormalizowane odkształcenie jądrowe wskazuje na zmniejszoną sztywność jądra, co obserwuje się w komórkach z obniżoną ekspresją białek otoczki jądrowej laminy A/C (Rycina 2).

Test manipulacji mikroigłami

W badaniu manipulacji mikroigłą obrazowano przemieszczenia jądra i cytoszkieletu podczas lokalnego przykładania naprężeń cytoszkieletowych. Komórki uszkodzone lub oddzielone od podłoża wykluczono z analizy. W analizie mierzymy wielkość ruchów jądra i cytoszkieletu w kierunku miejsca przykładania siły w pojedynczych, przylegających komórkach. Na przykład na Rysunku 3 śledzimy przemieszczenia mitochondriów (marker cytoszkieletu) przed i po zastosowaniu naprężenia cytoszkieletowego, a następnie przedstawiamy te przemieszczenia w formie wektorów. Każdy wektor reprezentuje przemieszczenie obliczone jako przesunięcie między pierwotną lokalizacją a nowo zidentyfikowaną pozycją. Regiony o niskiej intensywności obrazu lub niewystarczającej teksturze (np. obszary poza komórką) wykluczono z analizy. Przemieszczenia cytoszkieletu i jądra są następnie kwantyfikowane w wybranych obszarach w rosnącej odległości od miejsca przyłożenia naprężenia (Rysunek 4, obszary odpowiadające kolorowym polach na wstawce). W embrionalnych fibroblastach mysich z nienaruszonym sprzężeniem jądrowo-cytoszkieletowym siły są przenoszone przez całe komórki, co skutkuje indukowanymi deformacjami jądra i cytoszkieletu, które powoli zanikają wraz z oddalaniem się od miejsca przyłożenia naprężenia (Rysunek 4). W przeciwieństwie do nich, fibroblasty z zaburzonym sprzężeniem jądrowo-cytoszkieletowym (lub zmienioną organizacją cytoszkieletu) wykazują lokalne przemieszczenia w pobliżu miejsca przyłożenia siły, jak pokazano na Rysunku 4, oraz niewielkie indukowane deformacje w dalszych obszarach. Porównywalne naprężenie cytoszkieletowe w miejscu wprowadzenia mikroigły (pomarańczowe pole) zaobserwowano zarówno w fibroblastach kontrolnych (sam mCherry), jak i w fibroblastach z zaburzonym sprzężeniem jądrowo-cytoszkieletowym (DN KASH). Jednak indukowane przemieszczenia jądra i cytoszkieletu (pola niebieskie, żółte i czerwone) w pozostałych regionach były znacznie mniejsze w fibroblastach z zaburzonym sprzężeniem jądrowo-cytoszkieletowym (DN KASH) niż w komórkach kontrolnych (sam mCherry) (Rysunek 4). Zatem spadek przemieszczeń cytoszkieletu i jądra wraz z oddalaniem się od miejsca przyłożenia naprężenia wskazuje na zaburzenie przenoszenia siły między cytoszkieletem a jądrem.

Co istotne, potwierdziliśmy również, że mitochondria są odpowiednim markerem cytoszkieletu, przeprowadzając manipulacje za pomocą mikroiły na embrionalnych fibroblastach myszy przetransfekowanych aktyną GFP lub mCherry oraz vimentyną GFP i znakowanych fluorescencyjnie Mitotracker Green lub Red. Mapy przemieszczeń cytoszkieletu obliczono niezależnie na podstawie sygnału fluorescencyjnego mitochondriów oraz cytoszkieletu aktynowego lub vimentynowego. Średnie bezwzględne przemieszczenie obliczono dla czterech odrębnych regionów cytoszkieletu w rosnącej odległości od miejsca przyłożenia naprężenia. Nachylenie oraz wartości R-kwadrat obliczono z regresji liniowej pomiędzy pomiarami uzyskanymi z mitochondriów a pomiarami z aktyny lub vimentyny. W przypadku aktyny nachylenie wynosiło 0,99, a wartość R² wynosiła 0,986; w przypadku vimentyny nachylenie wynosiło 1,04, a wartość R2 wynosiła 0,971, co potwierdza, że przemieszczenia mitochondriów służą jako wiarygodne wskaźniki deformacji cytoszkieletu.

Rycina 1. Przykład nakładania odkształcenia podłoża na embrionalne fibroblasty mysie (MEFs). Embrionalne fibroblasty mysie rozprzestrzenione na dwóch odrębnych obszarach membrany krzemowej obrazowano za pomocą mikroskopii kontrastowej i fluorescencyjnej przed, w trakcie oraz po przyłożeniu 20% jednowymiarowego odkształcenia. (A) Przykład udanego eksperymentu z prawidłowymi jądrami komórkowymi w komórkach, które przetrwały przyłożenie odkształcenia bez żadnych uszkodzeń lub odczepienia oraz (B) przykład komórek, które uległy retrakcji/częściowemu odczepieniu podczas nakładania odkształcenia; wyniki z komórek przedstawionych w (B) zostały wykluczone z analizy. W (B) komórka po lewej stronie wykazuje oznaki uszkodzenia cytoszkieletu i kolapsu jądra (strzałka), natomiast komórka po prawej stronie częściowo odczepia się i kurczy podczas nakładania odkształcenia. Może to wskazywać na zbyt silne przyłożenie odkształcenia. Dla lepszego porównania, na obrazach (A) i (B) krawędź jednej z nieodkształconych błon komórkowych została obrysowana na czerwono i nałożona na tę samą komórkę w trakcie i po przyłożeniu odkształcenia. W (A) krawędź nieodkształconego jądra została obrysowana na zielono i nałożona na to samo jądro w trakcie i po przyłożeniu odkształcenia.

Rycina 2. Analiza znormalizowanego odkształcenia jądra w panelu różnych linii komórkowych MEF. Analizie poddano MEF o tle genetycznym Lmna^–/– oraz Lmna^+/– z ektopową ekspresją pustego wektora lub laminy A typu dzikiego. W porównaniu z MEF odybywających się z miotu typu dzikiego (Lmna^+/+), brak ekspresji laminy A/C skutkuje zmniejszoną sztywnością jądra, która może zostać w pełni przywrócona poprzez ponowne wprowadzenie laminy A typu dzikiego. Warto podkreślić, że zmniejszona sztywność jądra przekłada się na zwiększone wartości znormalizowanego odkształcenia jądra. Słupki błędów reprezentują błędy standardowe.

Rycina 3. Analiza manipulacji mikroigłą w celu pomiaru wewnątrzkomórkowej transmisji siły. Obrazy w kontraście fazowym (A, B) i fluorescencyjne (C, D) fibroblasta znakowanego barwnikiem jądrowym (niebieski) oraz barwnikiem mitochondriów MitoTracker (zielony). Mikroigłę wprowadzono do cytoszkieletu w określonej odległości od jądra (A i C), a następnie przesunięto w stronę peryferii komórki (B, D). Przesunięcia cytoszkieletu i jądra ilościowo określono poprzez śledzenie fluorescencyjnie znakowanego jądra i mitochondriów przy użyciu autorskiego algorytmu korelacji wzajemnej. (E) Mapa przesunięć końcowych deformacji cytoszkieletu (zielony) obliczona z serii obrazów fluorescencyjnych; długość strzałek powiększono 2x dla lepszej widoczności. Paski skali: 10 μm.

Rysunek 4. Analiza wewnątrzkomórkowej transmisji siły podczas manipulacji mikroi Igłą. Wywołane przemieszczenia cytoszkieletu i jądra podczas manipulacji mikroigłą, zmierzone w obszarach odpowiadających kolorowym ramkom (wstawka w A). Pomarańczowa ramka oznacza miejsce przyłożenia odkształcenia. Pomimo podobnego odkształcenia cytoszkieletu (pomarańczowa ramka), wywołane przemieszczenia jądra i cytoszkieletu (ramki niebieska, żółta i czerwona) były znacznie mniejsze w zarodkowych fibroblastach mysich z zaburzonym sprzężeniem nukleo-cytoszkieletowym (DN KASH) w porównaniu z komórkami kontrolnymi (sam mCherry).

Dyskusja

Analiza szczepów substratu

Aplikacja odkształcenia była z powodzeniem stosowana przez nas i inne grupy do badania indukowanych deformacji jądra w komórkach poddanych stresowi mechanicznemu oraz do badania wpływu specyficznych białek otoczki jądrowej na sztywność jądra.^4-8 Zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona badać właściwości mechaniczne żywych jąder w ich naturalnym środowisku komórkowym i cytoszkieletowym, a aplikacja odkształcenia podłoża przypomina aplikację obciążeń fizjolo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fibronektyna	EMD Millipore	FC010
MitoTracker Red FM i Green FM	Invitrogen	M22425 i M-7514
H–chst 33342	Invitrogen	H3570
Hank’bufor fizjologiczny z solą (BSS)	Invitrogen	14185
DMEM bez fenolu	Invitrogen	21063
Płodowa surowica bydlęca	Aleken Biologicals	FBSS500
Penicylina/streptomycyna	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
Szkło borokrzemowe z włóknem	Sutter Instrument Co.	BF100-78-10
Arkusz silikonowy błyszczący/błyszczący, niezbrojony, 0,005"	Specialty Manufacturing Inc.
Dulbecco’bufor solny z fosforanem (PBS)	Invitrogen	14200
szalki hodowlane z dna szklanego o średnicy 35 mm (FluoroDish)	World Precision Instruments, Inc.	FD35-100
Smar próżniowy Braycote 804	SPI Supplies	05133A-AB