Przedstawiamy dwa niezależne narzędzia oparte na mikroskopii, służące do pomiaru indukowanych odkształceń jądra i cytoszkieletu w pojedynczych, żywych komórkach przylegających w odpowiedzi na globalne lub lokalne przyłożenie naprężenia. Techniki te są wykorzystywane do określenia sztywności jądra (tj. odkształcalności) oraz do badania wewnątrzkomórkowej transmisji sił pomiędzy jądrem a cytoszkieletem.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analizy biofizyczne służące do badania właściwości mechanicznych interfazy jądra komórkowego: aplikacja odkształcenia podłoża i manipulacja mikroiłką
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W większości komórek eukariotycznych jądro jest największą organellą i jest zazwyczaj od 2 do 10 razy sztywniejsze niż otaczający je cytoškielet; w konsekwencji właściwości fizyczne jądra znacząco wpływają na ogólne zachowanie biomechaniczne komórek w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Na przykład w migrujących neutrofilach i naciekających komórkach nowotworowych sztywność jądra może stanowić główną przeszkodę podczas ekstrawasacji lub przechodzenia przez wąskie przestrzenie w tkankach.1 Z drugiej strony, jądra komórek w tkankach aktywnych mechanicznie, takich jak mięśnie, wymagają wystarczającego wsparcia strukturalnego, aby wytrzymać powtarzający się stres mechaniczny. Co ważne, jądro jest ściśle zintegrowane z architekturą komórkową; jest ono fizycznie połączone z otaczającym je cytoškieletem, co jest kluczowym wymogiem dla wewnątrzkomórkowego ruchu i pozycjonowania jądra, na przykład w komórkach spolaryzowanych, jądrach synaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych lub w komórkach migrujących.2 Nic dziwnego, że niedawno wykazano, iż mutacje w białkach otoczki jądrowej, takich jak lamine i nespryny, które odgrywają krytyczną rolę w określaniu sztywności jądra i sprzężenia jądro-cytoškieletowego, prowadzą do szeregu ludzkich chorób, w tym dystrofii mięśniowej Emerygo-Dreifussa, obręczowej dystrofii mięśniowej oraz rozstrzeniowej kardiomiopatii.3 Aby zbadać funkcję biofizyczną różnych białek otoczki jądrowej oraz wpływ specyficznych mutacji, opracowaliśmy metody eksperymentalne do badania właściwości fizycznych jądra w pojedynczych, żywych komórkach poddanych globalnemu lub lokalnemu zaburzeniu mechanicznemu. Pomiar indukowanych deformacji jądra w odpowiedzi na precyzyjnie zastosowane odkształcenie podłoża dostarcza ważnych informacji o odkształcalności jądra i pozwala na ilościowe porównanie różnych mutacji lub linii komórkowych z niedoborem specyficznych białek otoczki jądrowej. Lokalna aplikacja odkształcenia cytoškieletu za pomocą mikroiły jest stosowana jako uzupełnienie tego testu i może dostarczyć dodatkowych informacji o wewnątrzkomórkowym przenoszeniu sił między jądrem a cytoškieletem. Badanie mechaniki jądra w nienaruszonych żywych komórkach pozwala zachować normalną architekturę wewnątrzkomórkową i uniknąć potencjalnych artefaktów, które mogą pojawić się podczas pracy z izolowanymi jądrami. Ponadto aplikacja odkształcenia podłoża stanowi dobry model stresu fizjologicznego doświadczanego przez komórki w mięśniach lub innych tkankach (np. komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych poddane odkształceniu naczyniowemu). Wreszcie, choć narzędzia te zostały opracowane głównie do badania mechaniki jądra, mogą one być również stosowane do badania funkcji białek cytoškieletowych i sygnalizacji mechanotransdukcyjnej.
Protokół
1. Nakładanie odkształcenia na podłoże
Pomiar znormalizowanego odkształcenia jądra obejmuje przygotowanie płytek do odkształcania z przezroczystymi, elastycznymi membranami silikonowymi służącymi jako powierzchnia do hodowli komórek, wysiewanie komórek na płytki oraz pozyskiwanie obrazów komórek przed, w trakcie i po zastosowaniu odkształcenia (jednoosiowego lub dwuosiowego).
Przygotowanie szalek z membraną silikonową i adhezja komórek
- Każda szalka do rozciągania składa się z wykonanej na zamówienie plastikowej szalki bez dna o średnicy 3" oraz plastikowej uszczelki typu O-ring do mocowania membrany silikonowej, która służy jako podłoże do hodowli komórek. Aby przygotować szalki do rozciągania, zaklemuj fragment membrany silikonowej o wymiarach 4" x 4" pomiędzy uszczelką O-ring a szalką. Ostrożnie odetnij nadmiar membrany, wypłucz wodą dejonizowaną i wysterylizuj szalki w autoklawie.
- Przed pokryciem membran silikonowych cząsteczkami macierzy zewnątrzkomórkowej (np. fibronektyną), zaznacz punkt odniesienia w dolnym centrum membrany (od zewnętrznej strony). Punkt ten pomoże w identyfikacji tych samych komórek podczas eksperymentów z rozciąganiem. (Opcjonalnie: W przypadku stosowania rozciągania jednowymiarowego, wokół punktu odniesienia nakleja się dwa równoległe paski taśmy klejącej, aby ograniczyć deformację membrany w jednym wymiarze).
- Aby zapewnić optymalne przyleganie komórek, pokryj membrany silikonowe fibronektyną w stężeniu 3 μg/ml rozpuszczoną w 10 ml PBS lub dowolnymi odpowiednimi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej. Przykryj szalkę do rozciągania odwróconą polistyrenową szalką 10 cm i inkubuj szalki przez noc w temperaturze 4°C.
- Następnego dnia wypłucz membrany raz roztworem PBS (Phosphate Buffered Saline), aby usunąć nadmiar białka. Napełnij szalkę 10 ml pożywki wzrostowej (Dulbecco's Modified Eagles Medium (high glucose) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny/streptomycyny) i odstaw.
- Zarodkowe fibroblasty mysie poddaj trypsynizacji za pomocą 0,05% trypsyny i wysiej w pożywce wzrostowej przy konfluencji około 30% na pokrytą membranę silikonową, a następnie inkubuj przez 24–48 godzin w standardowych warunkach hodowli.
Eksperymenty dotyczące odkształcenia podłoża
- Przygotować mikroskop do przeprowadzenia eksperymentów. Doświadczenia wykonuje się na mikroskopie odwróconym z kamerą cyfrową przystosowaną do mikroskopii fluorescencyjnej, kontrastu fazowego lub DIC, używając obiektywu 60x oraz odpowiedniego oprogramowania do akwizycji obrazu (np. IPLab lub Metamorph). Mikroskop prosty nie nadaje się do tej aplikacji. Urządzenie do rozciągania składa się z płyty podstawy dopasowanej do stolika mikroskopu, która utrzymuje centralną cylindryczną płytę naciskową służącą do przyłożenia odkształcenia do środkowej sekcji membrany silikonowej, ruchomej płyty utrzymującej naczynie do rozciągania, która może przesuwać się w górę i w dół na czterech prowadnicach, a także płyty obciążnikowej o masie 5 lb w celu przyłożenia obciążenia.
- W celu wizualizacji jąder komórkowych inkubować komórki w naczyniu do rozciągania z 1 μg/mL Hoechst 33342 przez 15 min w 37°C. Odessać pożywkę i zastąpić ją 15 ml pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej (Dulbecco's Modified Eagles Medium (high glucose) bez czerwieni fenolowej z 25 mM Hepes, uzupełnione o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny). Wkręcić naczynie do rozciągania do płyty uchwytu naczynia. Ostrożnie nałożyć smar (Braycote 804 Vacuum Grease) na obwód spodu membrany silikonowej, aby zapewnić poślizg membrany wzdłuż centralnej płyty naciskowej. Należy upewnić się, że środkowa sekcja membrany pozostaje czysta.
- Umieścić płytę podstawy na stoliku mikroskopu. Ostrożnie zamontować płytę uchwytu naczynia na płycie podstawy. Upewnić się, że w początkowej pozycji spoczynkowej membrana silikonowa naczynia do rozciągania luźno opiera się o centralną płytę naciskową.
- Najpierw ustawić ostrość na spodzie membrany silikonowej i odnaleźć centralną czarną kropkę referencyjną. Kropka ta będzie służyć jako punkt startowy dla wszystkich akwizycji obrazów i pomoże w lokalizacji tych samych komórek w trakcie i po rozciąganiu. Używamy specjalnie napisanego programu do zautomatyzowanego obrazowania w celu zapisywania pozycji komórek i ich ponownej lokalizacji podczas eksperymentu, ale można to również osiągnąć ręcznie.
- Zaczynając od kropki, dostosować ostrość, aby zwizualizować komórki oraz górną część membrany silikonowej. Zlokalizować dobrze rozpłaszczone komórki z centralnie położonymi jądrami i wykonać obraz w kontraście fazowym oraz obraz fluorescencyjny barwienia jąder Hoechst. Obraz w kontraście fazowym powinien być ostry na obrysie komórki i membranie silikonowej, natomiast obrazy fluorescencyjne powinny być ostre na płaszczyźnie centralnej jądra.
- Po wykonaniu obrazów od 5 do 15 komórek powrócić do centralnej kropki. Powoli przyłożyć obciążnik do naczynia do rozciągania, co spowoduje jednorodne przyłożenie odkształcenia w centrum naczynia. Maksymalne przyłożone odkształcenie podłoża jest ograniczone przez nylonowe dystanse umieszczone na pionowych prowadnicach (pinach prowadzących).
- Ustawić ostrość na spodzie membrany silikonowej i ponownie zlokalizować kropkę referencyjną. Zaczynając od kropki, odnaleźć te same komórki i ponownie wykonać obraz w kontraście fazowym oraz obraz fluorescencyjny komórek i jąder przy pełnym odkształceniu, starając się jak najdokładniej dopasować płaszczyzny ogniskowania do obrazów początkowych. Proces ten nie powinien przekraczać 10 min, aby uniknąć aktywnego przebudowywania i adaptacji komórki do odkształconego podłoża.
- Po wykonaniu wszystkich odpowiadających sobie obrazów przesunąć stolik mikroskopu z powrotem do punktu startowego. Ostrożnie zdjąć obciążnik z płyty uchwytu naczynia i pozwolić membranie silikonowej rozluźnić się. W razie potrzeby delikatnie pchnąć naczynie do rozciągania w górę, aż znajdzie się w pozycji początkowej. Następnie wykonać obrazy w kontraście fazowym i fluorescencyjne komórek po rozciąganiu, zgodnie z opisem powyżej dla obrazów w trakcie rozciągania.
Analiza
- Obrazy komórek i jądra komórkowych znakowanych fluorescencyjnie przed, w trakcie i po przyłożeniu odkształcenia są analizowane w celu obliczenia znormalizowanego odkształcenia jądra. W naszym laboratorium do analizy wykorzystujemy autorski skrypt MATLAB, jednak dostępne są również alternatywne rozwiązania. Analiza jest przeprowadzana w trzech krokach.
- W pierwszym kroku, aby obliczyć przyłożone odkształcenie podłoża, pozycje od 3 do 6 punktów kontrolnych znajdujących się na membranie są ręcznie dopasowywane między odpowiadającymi sobie obrazami sprzed, w trakcie i po odkształceniu. Program MATLAB oblicza następnie przyłożone odkształcenie membrany poprzez porównanie pozycji dopasowanych punktów kontrolnych między obrazami sprzed odkształcenia a obrazami w pełnym odkształceniu, a także odkształcenie szczątkowe między obrazami sprzed i po odkształceniu. Jednocześnie punkty kontrolne służą do rejestracji par obrazów, co pomaga w wykryciu uszkodzonych lub odrywających się komórek (patrz Rycina 1).
- W drugim kroku jądra są wybierane ręcznie za pomocą osobnego programu MATLAB, który oblicza odkształcenie każdego pojedynczego jądra poprzez dopasowanie rozmiaru jądra lub markerów wewnątrzjądrowych między odpowiadającymi sobie obrazami fluorescencyjnymi sprzed, w trakcie i po odkształceniu. Aby uwzględnić niewielkie różnice w przyłożonym odkształceniu membrany między poszczególnymi eksperymentami, wyniki wyrażamy jako znormalizowane odkształcenie jądra, zdefiniowane jako stosunek indukowanego odkształcenia jądra do przyłożonego odkształcenia membrany obliczonego dla każdego jądra. Skrypty MATLAB są dostępne z laboratorium Lammerdinga na zapytanie.
- Na koniec każde jądro jest weryfikowane, a pomiary z komórek, które oderwały się lub uległy uszkodzeniu podczas przykładania odkształcenia, są wykluczane (Rycina 1).
2. Test manipulacji mikroigłami
Przygotowanie szalek, komórek adherentnych i mikroigieł
- Naczynia hodowlane z szklanym dnem o średnicy 35 mm inkubować z niskim stężeniem fibronektyny (0.5ug/ml) w soli fizjologicznej Hanksa (HBSS) lub innymi odpowiednimi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej przez 2 godziny w temperaturze 37°C. Przemyć naczynia HBSS dwa razy i dodać do każdego naczynia 2 ml pożywki wzrostowej przed przejściem do następnego kroku.
- Zarodkowe fibroblasty mysie poddać trypsynizacji przy użyciu 0.05% trypsyny i wysiać w 2 ml pożywki wzrostowej w zagęszczeniu 7.5 x 104 komórek/ml na szklane naczynia pokryte fibronektyną. Umieścić komórki w inkubatorze na noc. W przypadku innych typów komórek należy zoptymalizować liczbę komórek, aby uzyskać pojedyncze, przylegające, niekonfluente komórki.
- Wytworzyć mikroiły z kapilar borokrzemianowych, wyciągając je za pomocą komercyjnego wyciągacza do pipet (np. Sutter Instrument Company) do uzyskania średnicy końcówki wynoszącej około 1 do 3 μm.
Eksperyment z manipulacją mikroiigłami
- Następnego dnia inkubować komórki z barwnikiem mitochondriów MitoTracker (600 μM; Invitrogen) i barwnikiem jąder Hoechst 33342 (1 μg/mL) dodanymi do pożywki wzrostowej przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37°C.
- Przepłukać komórki raz w HBSS przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać do komórek pożywkę wzrostową bez czerwieni fenolowej w celu wykonania obrazowania.
- Nabyć jeden obraz pojedynczej komórki bez wprowadzonej w cytoszkielet mikroiły w kontraście fazowym, jeden obraz fluorescencyjny barwienia Hoechst 33342 oraz jeden obraz fluorescencyjny barwienia mitochondriów, używając obiektywu 60x (0.70 N.A., Plan-Achromat) w mikroskopie odwróconym z cyfrową kamerą CCD (charge-coupled device).
- Za pomocą mikromanipulatora (np. InjectMan NI 2, Eppendorf) ostrożnie wprowadzić mikroiłę do cytoplazmy komórki w stałej odległości (zazwyczaj 5 μm) od obwodu jądra, a następnie wykonać jeden obraz w kontraście fazowym, jeden obraz fluorescencyjny barwienia Hoechst 33342 oraz jeden obraz fluorescencyjny barwienia mitochondriów. W tej aplikacji pomocne jest sterowanie mikromanipulatorem za pomocą komputera, np. Windows Hyperterminal, aby zapewnić powtarzalność procedur mikromanipulacyjnych.
- Przesunąć mikroiłę na określoną odległość (zazwyczaj 10 lub 20 μm) w kierunku obwodu komórki z prędkością 1 μm/sec, jednocześnie rejestrując obrazy fluorescencyjne i w kontraście fazowym co 10 sekund. Gdy mikroiła przesuwa się na określoną odległość w stronę obwodu komórki, przy wybranych parametrach będzie to odpowiadać 2-3 klatkom podczas procesu manipulacji.
- Na koniec nabyć dodatkowe obrazy po usunięciu mikroiły z cytoszkieletu.
Analiza
- Mapy przemieszczeń są obliczane przy użyciu autorskiego skryptu MATLAB, opartego na śledzeniu fluorescencyjnie znakowanych struktur jądra i cytoplazmy. (Skrypt MATLAB jest dostępny w laboratorium Lammerding na zapytanie). Program wykorzystuje algorytm znormalizowanej korelacji wzajemnej pomiędzy małymi regionami obrazu (o rozmiarze około 10 μm x 10 μm, rozmieszczonymi w odstępach 5 μm) w kolejnych klatkach obrazu. Dla środka każdego regionu przemieszczenia w kierunkach x i y są obliczane jako przesunięcie między lokalizacją pierwotną a nowo zidentyfikowaną pozycją, a następnie wyświetlane jako wektory przemieszczenia i zapisywane jako wartości liczbowe. Na podstawie map przemieszczeń można obliczyć średnie przemieszczenia wewnątrz zdefiniowanych regionów. Należy pamiętać, że przemieszczenia cytoszkieletu są oparte na kanale fluorescencji dla markerów cytoszkieletu (np. barwienie mitochondriów MitoTracker), natomiast przemieszczenia jądra są obliczane z kanału fluorescencji odpowiadającego sygnałowi Hoechst 33342. W naszej aplikacji rutynowo badamy następujące regiony: (i) odkształcenie cytoszkieletu w miejscu przyłożenia naprężenia, tj. w miejscu wprowadzenia mikroiły; (ii) odkształcenie jądra w regionie wewnątrz jądra skierowanym w stronę miejsca przyłożenia naprężenia; (iii) odkształcenie jądra w regionie jądra oddalonym od miejsca przyłożenia naprężenia; oraz (iv) odkształcenie cytoszkieletu w regionie cytoplazmy po przeciwnej stronie jądra. Ponadto można bezpośrednio zmierzyć elongację jądra z sekwencji obrazów w kontraście fazowym lub fluorescencji Hoechst 33342. W tym przypadku przyłożone odkształcenie jądra oblicza się, dzieląc elongację jądra (ΔL = L – L0) przez długość początkową, L0, gdzie L jest długością końcową jądra po zakończeniu przyłożenia naprężenia, a L0 jest długością początkową jądra. W przypadku komórek z nienaruszoną łącznością jądro-cytoszkieletową, jądro będzie elongować w stronę miejsca przyłożenia naprężenia. W przeciwieństwie do tego, w komórkach, w których łączność jądro-cytoszkieletowa jest zaburzona, tj. siły są przenoszone mniej efektywnie między cytoszkieletem a jądrem, oczekuje się, że jądro będzie elongować znacznie mniej w kierunku miejsca przyłożenia naprężenia. Zatem zmniejszone deformacje jądra w odpowiedzi na przyłożone naprężenie cytoszkieletu wskazują na (częściowe) rozłączenie między jądrem a cytoszkieletem.
3. Reprezentatywne wyniki:
Przyłożenie odkształcenia podłoża
Pozyskano obrazy przed, w trakcie i po przyłożeniu odkształcenia do fibroblastów zarodkowych myszy z deficytem lamin A/C w formie heterozygotycznej i homozygotycznej (Lmna+/– oraz Lmna–/–) oraz myszy typu dzikiego (Lmna+/+), a następnie obliczono znormalizowane odkształcenie jądra dla każdej komórki. Po analizie zweryfikowano jądra, a komórki, które uległy uszkodzeniu lub wciągnęły się podczas przyłożenia odkształcenia, wykluczono z analizy. Rysunek 1A przedstawia jądra trzech komórek poprawnych, podczas gdy Rysunek 1B przedstawia komórki, które powinny zostać wykluczone z analizy. Dane dotyczące znormalizowanego odkształcenia jądra zgromadzono z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów (każdy zawierający pomiary z ~5–10 jąder) i porównano z innymi grupami komórek lub grupami traktowanymi za pomocą analizy statystycznej. Zwiększone znormalizowane odkształcenie jądra wskazuje na zmniejszoną sztywność jądra, co obserwowano w komórkach z obniżoną ekspresją białek otoczki jądrowej lamin A/C (Rysunek 2).
Test manipulacji mikroiłkami
W teście manipulacji mikroiigłą obrazowaliśmy przemieszczenia jądra i cytoszkieletu podczas lokalnego przykładania naprężenia cytoszkieletowego. Komórki uszkodzone lub oderwane zostały wykluczone z analizy. W analizie mierzymy wielkość ruchów jądra i cytoszkieletu w kierunku miejsca przyłożenia siły w pojedynczych, przylegających komórkach. Na przykład na rysunku 3 śledzimy przemieszczenia mitochondriów (marker cytoszkieletu) przed i po przyłożeniu naprężenia cytoszkieletowego, a następnie przedstawiamy przemieszczenia w postaci wektorów. Każdy wektor reprezentuje przemieszczenie obliczone jako różnica między położeniem pierwotnym a nowo zidentyfikowaną pozycją. Obszary o niskiej intensywności obrazu lub niewystarczającej teksturze (np. obszary poza komórką) są wykluczane z analizy. Następnie ilościowo określono przemieszczenia cytoszkieletu i jądra w wybranych obszarach w zwiększających się odległościach od miejsca przyłożenia naprężenia (rysunek 4, obszary odpowiadające kolorowym ramkom na wstawce). W zarodkowych fibroblastach mysich z nienaruszonym sprzężeniem jądrowo-cytoszkieletowym siły są przekazywane przez całe komórki, co prowadzi do indukowanych deformacji jądra i cytoszkieletu, które powoli zanikają wraz z odległością od miejsca przyłożenia naprężenia (rysunek 4). W przeciwieństwie do nich, fibroblasty z zaburzonym sprzężeniem jądrowo-cytoszkieletowym (lub zmienioną organizacją cytoszkieletu) wykazują lokalne przemieszczenia w pobliżu miejsca przyłożenia siły, jak pokazano na rysunku 4, oraz niewielkie deformacje indukowane w większej odległości. Porównywalne przyłożenie naprężenia cytoszkieletowego w miejscu wprowadzenia mikroigły (pomarańczowa ramka) zaobserwowano zarówno dla fibroblastów kontrolnych (sam mCherry), jak i fibroblastów z zaburzonym sprzężeniem jądrowo-cytoszkieletowym (DN KASH). Jednak indukowane przemieszczenia jądra i cytoszkieletu (niebieska, żółta i czerwona ramka) w innych obszarach były znacznie mniejsze w fibroblastach z zaburzonym sprzężeniem jądrowo-cytoszkieletowym (DN KASH) niż w komórkach kontrolnych (sam mCherry) (rysunek 4). Zatem zmniejszenie przemieszczeń cytoszkieletu i jądra wraz z odległością od miejsca przyłożenia naprężenia wskazuje, że przekazywanie siły między cytoszkieletem a jądrem zostało zaburzone.
Co istotne, potwierdziliśmy również, że mitochondria są odpowiednim markerem cytoszkieletu, przeprowadzając manipulacje mikroiłami na embrionalnych fibroblastach myszy przetransfekowanych aktyną GFP- lub mCherry oraz wimentyną GFP, a następnie znakowanych fluorescencyjnie barwnikiem Mitotracker Green lub Red. Mapy przemieszczeń cytoszkieletu obliczono niezależnie na podstawie sygnału fluorescencyjnego mitochondriów oraz cytoszkieletu aktynowego lub wimentynowego. Średnie bezwzględne przemieszczenie wyznaczono dla czterech odrębnych obszarów cytoszkieletu w rosnących odległościach od miejsca przyłożenia odkształcenia. Wartości nachylenia oraz R-kwadrat obliczono z regresji liniowej pomiędzy pomiarami uzyskanymi z mitochondriów a pomiarami z aktyny lub wimentyny. Dla aktyny nachylenie wyniosło 0,99, a wartość R2 0,986; dla wimentyny nachylenie wyniosło 1,04, a wartość R2 0,971, co potwierdza, że przemieszczenia mitochondriów służą jako wiarygodne wskaźniki deformacji cytoszkieletu.
Rysunek 1. Przyłożenie odkształcenia podłoża do zarodkowych fibroblastów mysich (MEFs). Zarodkowe fibroblasty mysie rozprzestrzenione na dwóch oddzielnych obszarach membrany krzemowej obrazowano za pomocą mikroskopii kontrastowej i fluorescencyjnej przed, w trakcie i po przyłożeniu 20% odkształcenia jednowymiarowego. (A) Przykład udanego eksperymentu z prawidłowymi jądrami komórkowymi komórek, które przetrwały przyłożenie odkształcenia bez żadnych uszkodzeń lub odklejenia oraz (B) przykład komórek, które kurczą się/częściowo odklejają podczas przyłożenia odkształcenia; wyniki z komórek przedstawionych w (B) zostały wykluczone z analizy. W (B) komórka po lewej stronie wykazuje oznaki uszkodzenia cytoszkieletu i zapadnięcia się jądra (strzałka), natomiast komórka po prawej stronie częściowo odkleja się i kurczy podczas przyłożenia odkształcenia. Może to być oznaka nadmiernego przyłożenia odkształcenia. Dla lepszego porównania, na (A) i (B) granica jednej z nieodkształconych błon komórkowych jest zaznaczona na czerwono i nałożona na tę samą komórkę w trakcie i po przyłożeniu odkształcenia. Na (A) granica nieodkształconego jądra jest zaznaczona na zielono i nałożona na to samo jądro w trakcie i po przyłożeniu odkształcenia.
Rysunek 2. Analiza znormalizowanego odkształcenia jądra w panelu różnych linii komórkowych MEF. Analizie poddano komórki MEF o tle genetycznym Lmna–/– i Lmna+/– z ektopową ekspresją pustego wektora lub laminy A typu dzikiego. W porównaniu do MEF od miotowych rówieśników typu dzikiego (Lmna+/+), utrata ekspresji lamin A/C prowadzi do zmniejszenia sztywności jądra, co można w pełni przywrócić poprzez ponowne wprowadzenie laminy A typu dzikiego. Należy zauważyć, że zmniejszona sztywność jądra objawia się zwiększonymi wartościami znormalizowanego odkształcenia jądra. Słupki błędu reprezentują błędy standardowe.
Rycina 3. Test manipulacji mikroiłką w celu pomiaru wewnątrzkomórkowego przekazywania sił. Obrazy w kontraście fazowym (A, B) i fluorescencyjne (C, D) fibroblasta znakowanego barwnikiem jądrowym (niebieski) oraz barwnikiem mitochondriów MitoTracker (zielony). Mikroiłkę wprowadzono do cytoszkieletu w określonej odległości od jądra (A i C), a następnie przesunięto w kierunku peryferii komórki (B, D). Przesunięcia cytoszkieletu i jądra ilościowo określono poprzez śledzenie fluorescencyjnie znakowanego jądra i mitochondriów przy użyciu autorskiego algorytmu korelacji wzajemnej. (E) Mapa przesunięć końcowych deformacji cytoszkieletu (zielony) obliczona z serii obrazów fluorescencyjnych; długość strzałek została powiększona 2x dla lepszej widoczności. Paski skali, 10 μm.
Rycina 4. Analiza wewnątrzkomórkowej transmisji siły podczas manipulacji mikroiłą. Wywołane przemieszczenia cytoszkieletu i jądra podczas manipulacji mikroiłą, zmierzone w obszarach odpowiadających kolorowym polom (wstawka w A). Pomarańczowe pole oznacza miejsce przyłożenia odkształcenia. Pomimo podobnego przyłożenia odkształcenia do cytoszkieletu (pomarańczowe pole), wywołane przemieszczenia jądra i cytoszkieletu (pola niebieskie, żółte i czerwone) były znacznie mniejsze w embrionalnych fibroblastach mysich z zaburzonym sprzężeniem jądrowo-cytoszkieletowym (DN KASH) w porównaniu z komórkami kontrolnymi (same mCherry).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Analiza szczepów substratu
Aplikacja odkształcenia była z powodzeniem stosowana przez nas i inne grupy do badania indukowanych deformacji jądra w komórkach poddanych stresowi mechanicznemu oraz do badania wpływu specyficznych białek otoczki jądrowej na sztywność jądra.4-8 Zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona badać właściwości mechaniczne żywych jąder w ich naturalnym środowisku komórkowym i cytoszkieletowym, a aplikacja odkształcenia podłoża przypomina aplikację obciążeń fizjolo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health (R01 HL082792 oraz R01 NS059348) oraz Brigham and Women's Hospital Cardiovascular Leadership Group Award.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Fibronektyna | EMD Millipore | FC010 | |
| MitoTracker Red FM i Green FM | Invitrogen | M22425 i M-7514 | |
| H–chst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Hank’bufor fizjologiczny z solą (BSS) | Invitrogen | 14185 | |
| DMEM bez fenolu | Invitrogen | 21063 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
| Penicylina/streptomycyna | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Szkło borokrzemowe z włóknem | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | |
| Arkusz silikonowy błyszczący/błyszczący, niezbrojony, 0,005" | Specialty Manufacturing Inc. | ||
| Dulbecco’bufor solny z fosforanem (PBS) | Invitrogen | 14200 | |
| szalki hodowlane z dna szklanego o średnicy 35 mm (FluoroDish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Smar próżniowy Braycote 804 | SPI Supplies | 05133A-AB |
Bibliografia
- Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. Nuclear mechanics during cell migration. Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).
- Mejat, A., Misteli, T. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1, 40-52 (2010).
- Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy. J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).
- Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate. Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).
- Lammerding, J. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).
- Lammerding, J. Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells. J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).
- Lammerding, J. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
- Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors. Aging Cell. 7, 383-393 (2008).
- Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488, 459-469 (1995).
- Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure. Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
