Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Transfekcja komórek 293T lucyferazy i pobranie supernatantu wirusa
- Posiew komórek 293T
- Przygotuj pożywkę, dodając do litra zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco każdy: 110 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 11 ml penicyliny-streptomycyny.
- Rozmrozić 5 x 106 komórek 293T i przenieść je do kolby T175 z pożywką przygotowaną w sposób opisany powyżej.
- Podziel komórki 293T 1:10 co 3 dni przez 6 dni. Nie pozwól, aby komórki stały się zlewające się w więcej niż 90%.
- Transfekcja komórek 293T
nuta: Następujące ilości odczynników oblicza się dla transfekcji jednej kolby T175 z komórkami 293T. Odpowiednio dostosować, jeżeli ma być przeprowadzony większy przepływ kolb.
- Przenieś 1,5 ml pożywki do każdej z dwóch probówek o pojemności 50 ml za pomocą pipety. Do jednej probówki dodaj 10 μg plazmidu VSV-G, 20 μg Gag/pol i 20 μg plazmidu lucyferazy pomidora TD z czerwonego chrząszcza (CBR-TDR) i wymieszaj. Do drugiej probówki dodać 100 μl odczynnika do transfekcji DNA in vitro i wymieszać. Inkubować obie probówki w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 min.
nuta: Wszystkie plazmidy opisane w tym manuskrypcie zostały dostarczone przez dr Władimira Ponomariowa.
- Przenieść pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji DNA in vitro kroplami do probówki zawierającej plazmidy DNA (przez około 30 s) i delikatnie wymieszać pipetą. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
- Podczas tej 20-minutowej inkubacji odłącz komórki 293T, dodając 5-10 ml 0,05% trypsyny. Po odłączeniu komórek dodać 10 ml pożywki i wirować przy 800 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml pożywki.
- Dodać pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji DNA in vitro i plazmidy DNA do komórek 293T i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
- Przenieść do kolby T175 i dodać 18 ml pożywki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
- Następnego dnia ostrożnie odessać pożywkę szklaną pipetą, nie odłączając komórek. Zastąp 18 ml świeżego podłoża. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc w inkubatorze.
- Zbieranie supernatantu wirusowego
- Usunąć wirusowy supernatant za pomocą pipety umieszczonej na lodzie. Wirować przy 800 x g przez 5 minut, aby granulować komórki i zanieczyszczenia.
nuta: Jeśli osad komórkowy jest duży, komórki zostały prawdopodobnie oderwane od kolby po usunięciu supernatantu. Komórki te można ponownie posiać w nowej kolbie ze świeżą pożywką.
- Przefiltrować supernatant wirusa za pomocą filtra 0,22 μm.
- Wirusowy supernatant należy natychmiast zużyć. Przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C do 24 godzin lub zamrażać w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
2. Ekspansja i transdukcja aktywowanych ludzkich limfocytów T za pomocą lucyferazy
- Aktywacja ludzkich limfocytów T in vitro
- Przemyć kulki, dodając 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do sterylnej probówki o pojemności 15 ml, dodając kulki (jedna kulka na dwie limfocyty T), umieszczając w stojaku magnetycznym na 2 minuty i odsysając PBS.
- Przygotować pożywkę zgodnie z opisem w kroku 1.1.1, następnie dodać IL-2 do końcowego stężenia 30 j.m./ml i dodać umyte kulki. Przygotuj 2,5 ml pożywki na każde dwa miliony limfocytów T, które mają być aktywowane.
- Policz limfocyty T (świeżo oczyszczone lub wcześniej oczyszczone, zamrożone, rozmrożone i umyte) za pomocą hemocytometru i barwienia błękitem trypanowym. Dodaj limfocyty T do pożywki przygotowanej w kroku 2.1.2 i delikatnie odwróć probówkę, aby wymieszać. Limfocyty T rozszerzą się co najmniej 20 razy w zależności od źródła i ogólnego stanu zdrowia komórek. Określ liczbę limfocytów T do aktywacji, obliczając liczbę potrzebną do leczenia myszy i dzieląc przez 20. W tym przypadku użyto 20 x 106 limfocytów T na mysz na podstawie wstępnych eksperymentów.
- Płytka 2,5 ml pożywki zawierającej dwa miliony limfocytów T, kulki i (interleukina 2) IL-2 w każdym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Hodowla w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
- Badaj limfocyty T pod mikroskopem 20x codziennie przez następne 3 dni, aby określić, kiedy należy transdukować lucyferazy. Komórki są gotowe, gdy zlepiają się ze sobą i wyczerpują pożywkę, zmieniając ją z czerwono-różowej na jasnopomarańczową.
- Przygotowanie płytek z retronektyną
nuta: Retronektyna służy do powlekania płytek używanych w transdukcji, ponieważ zwiększa transdukcję genów.
- Dodać 2 ml 20 μg/ml retronektyny w PBS do dołka na niepoddanej działaniu 6-dołkowej płytki. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Do transdukcji każdych dwóch milionów limfocytów T potrzebna jest jedna studzienka pokryta retronektyną.
- Odessać retronektynę bez drapania dna płytki.
- Dodać 3 ml 2% BSA w PBS (sterylnie przefiltrowany) na studzienkę na płytkę 6-dołkową. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Spinokulacja
- Zassać BSA bez rysowania dolnej części płytki.
- Umyj studzienki raz 3 ml PBS na studzienkę. Kontynuować lub zastąpić nowym PBS i pozostawić płytkę pod przykryciem w temperaturze 4 °C na noc.
- Dodać 2 ml supernatantu wirusa lucyferazy CBR-TDR (zebranego w kroku 1.3) do dołka.
- Wirować przy 1,240 x g przez 90 minut w temperaturze 32 °C.
- Transdukcji
- Policz limfocyty T.
- Odessać wirusowy supernatant bez drapania dna płytki.
- Płytka dwa miliony limfocytów T na studzienkę w 6 ml DMEM zawierającym 30 j.m./ml ludzkiej IL-2.
- Codziennie badaj limfocyty T. Limfocyty T są gotowe do namnażania, gdy są prawie zlewające się, zwykle po 2 dniach.
- Gdy komórki są już prawie zlewające się, delikatnie zmyj je z dna płytki za pomocą pipety i przenieś każdą studzienkę do oddzielnej kolby T75. Dodać 9 ml pożywki, co daje w sumie 15 ml pożywki na kolbę.
- Następnego dnia dodaj dodatkowe 15 ml pożywki. Komórki powinny być gotowe do wstrzyknięcia myszom następnego dnia po dodaniu pożywki. Potwierdź pomyślną transdukcję, wykonując cytometrię przepływową (konstrukt lucyferazy zawiera fluorofor pomidora TD, który jest widoczny w kanale PE).
3. Wszczepienie limfocytów T transdukowanych lucyferazą u myszy z obniżoną odpornością
- Przygotować i policzyć limfocyty T do wstrzyknięcia.
- Usunąć limfocyty T z kolb i policzyć. Komórki są gotowe do wstrzyknięcia, gdy rozszerzą się 20-30 razy, zwykle do 7 dnia po aktywacji.
- Odwirować limfocyty T przy 800 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić w 2 ml pożywki i usunąć kulki za pomocą stojaka magnetycznego.
- W przypadku eksperymentów, w których limfocyty T będą wstrzykiwane oddzielnie od przeciwciał bispecyficznych, należy policzyć limfocyty T i zawiesić ponownie, tak aby końcowe stężenie wynosiło 20 milionów limfocytów T na 100 μl pożywki. Przejdź do kroku 3.2. W przypadku eksperymentów z użyciem uzbrojonych limfocytów T ex vivo (EAT) należy przejść do kroku 3.1.4.
- W przypadku eksperymentów z użyciem uzbrojonych limfocytów T ex vivo, policz limfocyty T i rozdziel je na indywidualne probówki o pojemności 1,5 ml dla każdej grupy, z 20 milionami komórek na mysz. Na przykład, jeśli istnieją trzy grupy po pięć myszy każda, przygotuj trzy probówki o pojemności 1,5 ml z 100 milionami limfocytów T każda.
- Odwirować probówki o pojemności 1,5 ml o stężeniu 800 x g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć pożywkę, nie naruszając osadu limfocytów T. Zawiesić w nie więcej niż 50 μl pożywki zawierającej przeciwciała bispecyficzne. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
nuta: Na potrzeby eksperymentów przeprowadzonych w tym badaniu wykorzystano opatentowane bispecyficzne przeciwciała IgG-[L]-scFv angażujące limfocyty T wytworzone w laboratorium. Do uzbrajania limfocytów T użyj 5 μg przeciwciała na 20 x 106 limfocytów T. Można również zastosować dostępne na rynku przeciwciała bispecyficzne.
- Zmyj nadmiar przeciwciał, dodając 1 450 μl pożywki do każdej probówki. Wirować przy 800 x g przez 5 minut, ostrożnie zassać pożywkę i ponownie zawiesić w stężeniu 20 milionów uzbrojonych limfocytów T na 100 μl pożywki.
- Wstrzyknięcie i wszczepienie myszom
- Znieczulenie myszy należy umieścić w komorze dostarczającej 3,5% (v/v) wdychanego izofluranu w ilości 1 l/min tlenu. Myszy są w pełni znieczulone, gdy zniknie odruch wycofania pedału tylnej kończyny.
UWAGA: Zapewnij wsparcie termiczne przez cały czas trwania zabiegu.
- Za pomocą igły 26 G wstrzyknij 20 milionów limfocytów T w 100 μl pożywki zaoczodołowo na mysz.
- Podawać podskórnie rekombinowaną IL-2 1,000 U, aby wspomóc przeżycie limfocytów T in vivo.
- Przeciwciała bispecyficzne podawać zaoczodołowo (do oka nieużywanego do wstrzykiwania limfocytów T) lub dootrzewnowo. Pozwól myszom dojść do siebie po znieczuleniu i wrócić do klatek.
UWAGA: Ponownie, w tym przypadku, użyto zastrzeżonych przeciwciał, które zostały wygenerowane w laboratorium, ale zamiast nich można było użyć komercyjnie dostępnych przeciwciał. W eksperymentach podano 0,3-10 μg przeciwciał na mysz na dawkę. Przeciwciała podawano dwa razy w tygodniu przez 3-4 tygodnie.
4. Obrazowanie in vivo myszy wszczepionych komórkami T transdukowanymi lucyferazy
UWAGA: Ten krok należy wykonać w dniu obrazowania, który niekoniecznie jest tym samym dniem, w którym limfocyty T i/lub przeciwciała są podawane myszom. Zazwyczaj obrazowanie wykonujemy 24 godziny po podaniu limfocytów T transdukowanych lucyferazy.
- Przygotowanie D-lucyferyny
- Rozpuścić 1 g D-lucyferyny w 33,3 ml sterylnego PBS (końcowe stężenie: 30 mg/ml).
- Rozpuszczoną D-lucyferynę rozmieścić w probówkach do mikrowirówek o pojemności 33 x 1,5 ml i utrzymywać probówki w temperaturze -20 °C.
- W dniu obrazowania rozmrozić wystarczającą ilość porcji 30 mg/ml D-lucyferyny, aby liczba zwierząt została zobrazowana. Jedna tuba wystarcza na 10 zwierząt.
UWAGA: Po użyciu ponownie zamrozić pozostałą D-lucyferynę. D-lucyferyna jest stabilna przez co najmniej pięć cykli zamrażania/rozmrażania.
- Podawanie D-lucyferyny myszom
nuta: Przed podaniem D-lucyferyny myszom otwórz oprogramowanie do obrazowania i zainicjuj system. Aparat może potrzebować kilku minut, aby ostygnąć, i należy to zrobić przed wstrzyknięciem myszom D-lucyferyny, aby upewnić się, że obrazowanie może odbyć się 5 minut po podaniu substratu.
- Znieczulić do pięciu myszy w komorze dostarczającej 3,5% (v/v) wdychany izofluran w 1 l/min tlenu. Myszy są w pełni znieczulone, gdy zniknie odruch wycofania pedału tylnej kończyny.
- Gdy myszy zostaną w pełni znieczulone, podaj 100 μl 30 mg / ml D-lucyferyny na mysz (3 mg na mysz) przez wstrzyknięcie zaoczodołowe za pomocą igły 26 G. Wyobraź sobie tę grupę myszy przed podaniem D-lucyferyny następnej grupie. Umieść następną grupę myszy w komorze izofluranu w celu znieczulenia, podczas gdy poprzednia grupa jest obrazowana.
- Obrazowanie limfocytów T transdukowanych lucyferazą
- Przenieś znieczulone myszy do światłoszczelnej komory kamery, a następnie kontynuuj podawanie 3% izofluranu w dawce 0,5 l/min. Ułóż myszy na boku tak, aby bok, na którym znajduje się ksenoprzeszczep, był skierowany do góry w kierunku kamery. Wykonaj kolejny zestaw zdjęć z myszami w pozycji leżącej, aby ocenić obecność limfocytów T w płucach.
- Korzystając z panelu sterowania akwizycją, wybierz opcje Luminescencyjne, Fotografia i Nakładka. Ustaw czas ekspozycji na automatyczny, binning na średni, a F/Stop na 1. Pobieranie obrazów. Po pierwszym zdjęciu ustaw czas ekspozycji tak, aby odpowiadał czasowi, który został automatycznie obliczony dla pierwszego obrazu, aby można było bezpośrednio porównywać kolejne obrazy. Przydatne może być przechwytywanie obrazów z wielokrotnymi czasami naświetlania w celu określenia optymalnego czasu ekspozycji w celu uzyskania najjaśniejszego sygnału bez nasycenia pikseli.
- Usuń myszy z izofluranu, wróć do ich klatek i obserwuj, aż się obudzą i będą chodzić.
- Powtarzaj kroki od kroku 4.2.1, aż wszystkie grupy zostaną zobrazowane.
