Wytwarzanie przeciwciał z okresowej hodowli przerostu transfekowanych komórek ssaków

Streszczenie

Źródło: Elgundi, Z. et al., Produkcja i oczyszczanie przeciwciała terapeutycznego na skalę laboratoryjną.J. Vis. Exp.(2017)

Film demonstruje metodę wytwarzania przeciwciał terapeutycznych przy użyciu stabilnie transfekowanych komórek ssaków. Suplementacja tryptonem stymuluje podział komórek, powodując przerost i wspierając wyższą wydajność przeciwciał. Pożywka zawierająca przeciwciała jest zbierana, filtrowana i przechowywana do dalszego wykorzystania.

Protokół

UWAGA: Dla tego protokołu musi być użyty odpowiedni wektor ekspresji ssaków. W tym przypadku używana jest pojedyncza konstrukcja zawierająca dwie kasety wyrażeń (tj. wyrażenie o ciężkim i lekkim łańcuchu jest sterowane przez oddzielne promotory). Ciężkie i lekkie łańcuchy trastuzumabu były wcześniej klonowane do wektora. Wektor ten był prezentem od Andrew Beavil, uzyskanym za pośrednictwem repozytorium plazmidów non-profit.

1. Odzyskiwanie i zwiększanie skali DNA wektora

UWAGA: DNA wektora zostało odebrane jako miękka kultura ukłucia agarem w szczepie Escherichia coli XL-1 Blue; wektor jest odporny na higromycynę.

1. Włożyć sterylny zastrzyk lub pętelkę do miękkiego agaru kultury kłującej, a następnie przetrzeć płytkę z agarem Luria Bertani (LB) przygotowaną z 75 μg/ml higromycyny dla izolowanych kolonii. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 18-24 godziny.
2. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 5 ml Terrific bulion (TB) zawierający 75 μg/ml higromycyny. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przez 18-24 godziny, wytrząsając przy 225 obr./min.
3. Użyć kultury przez noc, aby przygotować zapas glicerolu z DNA wektora, delikatnie mieszając 800 μl kultury z 200 μl 80% glicerolu w kriowiale i zamrażając w temperaturze -80 °C.
   1. Dodać 100 μl nocnej kultury do 100 ml gruźlicy zawierającej 75 μg/ml higromycyny w przegrodzie wytrząsającej (tj. rozcieńczenie 1:1 000). Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przez 18-24 godziny z wytrząsaniem 225 obr./min.
4. Po całonocnej hodowli wyekstrahować i oczyścić kwas nukleinowy (DNA) dezoksyrybozy zgodnie z instrukcjami producenta dla zestawu do przygotowania midi/maxi, z następującym wyjątkiem: podczas ostatniego etapu wymyć lub ponownie zawiesić DNA wodą (pH 7,0-8,5).
5. Sprawdzić stężenie i czystość DNA za pomocą odczytów absorbancji przy 260 i 280 nm, a następnie przechowywać DNA w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: Opcjonalnie (wysoce zalecane): Sekwencjonuj DNA przy użyciu starterów specyficznych dla wektora, aby potwierdzić tożsamość.

2. Stabilna transfekcja komórek HEK-293

1. Hoduj i utrzymuj komórki HEK-293 (komórki zawiesinowe) zgodnie ze standardowymi protokołami w pożywkach bez surowicy uzupełnionych 0,1% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w kolbach Erlenmeyera. Utrzymywać w dawce 2 x 10⁵ komórek/ml i subkulturować co czwarty dzień. Komórki hodowlane w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla (CO₂ ) i obrotem 120 obr./min.
   UWAGA: Komórki powinny znajdować się w hodowli nie krócej niż 4 dni i nie dłużej niż 4 tygodnie przed transfekcją. Komórki HEK-293 hodowane jako monowarstwy w pożywkach zawierających surowicę mogą być również używane do tej procedury.
2. W dniu poprzedzającym transfekcję, wysiewaj komórki HEK-293 w ilości 3 x 10⁵ komórek/ml w dołkach 12-dołkowej płytki w 2 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionego 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS). W dniu transfekcji sprawdź, czy komórki osiągnęły 80-90% zbiegu
3. Rozcieńczyć DNA i polietylenininę (PEI) oddzielnie w pożywce transfekcyjnej, a następnie wymieszać je ze sobą.
   1. Rozcieńczyć 1,25 μg wektora DNA na studzienkę (15 μg na 12 dołków) w 300 μl pożywki transfekcyjnej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   2. Rozcieńczyć 2,5 μl roztworu PEI o stężeniu 1 mg/ml (30 μl na 12 dołków, tj. stosunek 1:2 DNA do PEI) w 300 μl pożywki do transfekcji. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   3. Dodaj rozcieńczone DNA do rozcieńczonego PEI, delikatnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
4. Dodawać kroplami 50 μl mieszaniny DNA/PEI do każdego dołka płytki. Delikatnie kołysz płytką, aby rozprowadzić mieszaninę transfekcji, a następnie umieść płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ na 24 godziny.
5. Dodać 50 μg/ml higromycyny B na studzienkę i przywrócić płytkę do temperatury 37 °C, 5% CO₂ na 10 dni.
   UWAGA: Do 10 dnia nietransfekowane komórki obumrą i oderwą się od powierzchni płytki, podczas gdy stabilnie transfekowane komórki będą żywotne i przyczepione do płytki.
6. Zastąp pożywkę w studzienkach pożywką bez surowicy o objętości 1/4 i DMEM o objętości 3/4 objętości uzupełnioną 10% FBS (tj. 0,5 ml pożywki bez surowicy + 1,5 ml DMEM = 7,5% końcowego stężenia w surowicy) i inkubuj przez 4 dni.
7. Zastąp pożywkę w studzienkach pożywką bez surowicy o objętości 1/2 i DMEM o objętości 1/2 objętości uzupełnioną 10% FBS (tj. 1 ml pożywki bez surowicy + 1 ml DMEM = 5% końcowe stężenie w surowicy) i inkubuj przez 4 dni.
8. Zastąp pożywkę w studzienkach pożywką bez surowicy o objętości 3/4 i DMEM o objętości 1/4 uzupełnioną 10% FBS (tj. 1,5 ml pożywki bez surowicy + 0,5 ml DMEM = 2,5% końcowego stężenia w surowicy) i inkubuj przez 4 dni.
9. Zastąp pożywkę w studzienkach 2 ml pożywki bez surowicy uzupełnionej 0,1% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym (tj. 0% końcowym stężeniem surowicy) i inkubuj przez 4 dni.
   UWAGA: Utrzymuj selektywny nacisk 50 μg/ml higromycyny B na komórki podczas adaptacji bez surowicy. Komórki przystosowane do pożywek bezsurowicowych odrywają się od powierzchni studzienek i mogą gromadzić się w zawiesinie. Patrz krok 2.1, aby zapoznać się z warunkami hodowli z dodatkowym dodatkiem 50 μg/ml higromycyny B.
10. Za pomocą pipety delikatnie wymieszać kultury zawiesinowe na płytce 12-dołkowej i komórki puli w osobnej probówce.
    1. Za pomocą hemocytometru zliczyć połączone komórki i nasiona w 30 ml pożywki bez surowicy w kolbie Erlenmeyera przy 2 x 10⁵ komórek/ml. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ i rotacji 120 obr./min. Subkultura i rozwijaj się co czwarty dzień.
11. Kontynuuj zwiększanie wielkości hodowli do wymaganej gęstości komórek, aby uzyskać 10 fiolek o wymiarach 1 x 10⁷ komórek/fiolkę do kriokonserwacji w ciekłym azocie. Zamrozić komórki w pożywce bez surowicy zawierającej 10% dimetylosulfotlenku (DMSO).
    UWAGA: Kondycjonowane pożywki zawierające przeciwciała mogą być zbierane w każdej subkulturze w celu potwierdzenia produkcji białka lub wykorzystane do optymalizacji warunków oczyszczania. Aby zebrać kondycjonowaną pożywkę i utrzymać komórki do subkultury, odwiruj kulturę przy 300 x g przez 5 minut, a następnie przefiltruj i wysterylizuj supernatant przez filtr 0,22 μm. Przefiltrowany supernatant może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez 1–2 tygodnie lub -20 °C w przypadku dłuższego przechowywania.

3. Produkcja przeciwciał na dużą skalę z hodowli nadmiernej

UWAGA: Produkcja przeciwciał może być kontynuowana od kroku 2.11, gdzie istniejące komórki są rozszerzane do wymaganej gęstości komórek w oparciu o objętość hodowli przerostu partii, która ma być ustawiona. W przeciwnym razie komórki, które zostały rozmrożone w wyniku kriokonserwacji, rozpoczynają się na tym etapie, gdy zostaną rozszerzone do odpowiedniej gęstości i objętości komórek. W celu optymalizacji produkcji przeciwciał można stosować różne suplementy hodowlane; W protokole tym wykazano zastosowanie tryptonu w celu zwiększenia wydajności przeciwciał.

1. Komórki nasienne w ilości 2 x 10 5 komórek/ml w 100 ml pożywki bez surowicy w dwóch kolbach Erlenmeyera (w celu porównania wydajności przeciwciał z kultur niesuplementowanych i uzupełniających składniki odżywcze). Kultura w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i 120 obr./min.
2. Po 24 godzinach dodaj trypton do końcowego stężenia 0,5% do kultury wzbogaconej składnikami odżywczymi. Wyrównaj objętość nieuzupełnionej kultury za pomocą pożywki bez surowicy.
3. Od 8 dnia codziennie wykonuj zliczanie komórek w kulturach za pomocą hemocytometru w celu monitorowania żywotności komórek. Zebrać supernatanty hodowlane, gdy żywotność komórek jest mniejsza niż 80%.
   1. Zebrać supernatant przez odwirowanie kultur przy 3 000 x g przez 15 minut, a następnie przefiltrować i wysterylizować supernatant (zawierający przeciwciało) przez filtr 0,22 μm. Przechowywać supernatanty w temperaturze 4 °C (krótkotrwale) lub zamrażać w temperaturze -20 °C (długotrwale).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Seria wektorów pFUSE	N/a	InvivoGen	Ciężkie i lekkie geny przeciwciał ulegające ekspresji w oddzielnych wektorach, które wymagają kotransfekcji.
Seria wektorów mAbXpress	N/a	ACYTE Biotech Pty Sp. z o.o.	Ciężkie i lekkie geny przeciwciał ulegające ekspresji w oddzielnych wektorach, które wymagają kotransfekcji. Patrz: Jones, M. L. i wsp. Metoda szybkiego, niezależnego od ligacji formatowania rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych. J Metody immunologiczne. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
Grafika wektorowa pVITRO1	N/a	N/a	Ciężkie i lekkie geny przeciwciał są napędzane przez oddzielny promotor w jednym wektorze. Patrz: Dodev, T. S. et al. Zestaw narzędzi do szybkiego klonowania i ekspresji rekombinowanych przeciwciał. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
Seria wektorowa GS	N/a	Lonza	Wektor multicistroniczny z ciężkimi i lekkimi genami przeciwciał ulegającymi koekspresji i translacji jako pojedynczy transkrypt.
Wektor multi-cistroniczny serii 1	N/a	N/a	Wektor multicistroniczny z ciężkimi i lekkimi genami przeciwciał ulegającymi koekspresji i translacji jako pojedynczy transkrypt. Patrz: Li, J. i wsp. Badanie porównawcze różnych projektów wektorów do ekspresji rekombinowanych przeciwciał IgG u ssaków. J Metody immunologiczne. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistroniczna seria wektorowa 2	N/a	N/a	Wektor multicistroniczny z ciężkimi i lekkimi genami przeciwciał ulegającymi koekspresji i translacji jako pojedynczy transkrypt. Patrz: Ho, SC i in. Wektory tricistroniczne za pośrednictwem IRES w celu zwiększenia wytwarzania linii komórkowych CHO o wysokiej ekspresji przeciwciał monoklonalnych. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-trastuzumab-IgG1/κ	Numer katalogowy: 61883	Addgene powiedział:	Wektor ekspresyjny ssaków zawierający geny przeciwciała trastuzumabu z genem oporności na higromycynę; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ był darem od Andrew Beavila.
Agar higro Fast-Media	FAS-HG-S	Badania Jomar Life	Służy do przygotowania agaru LB o niskiej zawartości soli zawierającego 75 μg/ml higromycyny.
Fast-Media Hygro TB	FAS-HG-L	Badania Jomar Life	Służy do przygotowania bulionu gruźlicy o niskiej zawartości soli zawierającego 75 μg/ml higromycyny.
Glicerol, BioXtra, ≥99%	Zobacz materiał G6279	Sigma-Aldrich	Przygotuj do 80% z wodą i autoklawem. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
Zestaw Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi	G221020	Astralny Naukowy	Plasmid Maxi Prep Kit; eluować lub ponownie zawiesić DNA w wodzie (pH 7,0-8,5).
Ogniwa FreeStyle 293-F	Przekaźnik R790-07	Technologie życiowe	Linia komórkowa HEK-293 przystosowana do hodowli zawiesinowej w pożywce bez surowicy.
FreeStyle 293 Expression Średni	Numer katalogowy: 12338-018	Technologie życiowe	Pożywka bez surowicy specjalnie opracowana do utrzymania linii komórkowej 293-F i wysokiej ekspresji białka.
Kolliphor P188	Zobacz materiał K4894	Sigma-Aldrich	Niejonowy środek powierzchniowo czynny; pluroniczny F-68; przygotować do 10% w wodzie i przefiltrować-wysterylizować za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4oC.
DMEM, wysoki poziom glukozy	Numer katalogowy 11995-065	Technologie życiowe
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca	Numer katalogowy 10082-147	Technologie życiowe
Polietylenin, liniowy, MW 25,000	Numer katalogowy: 23966	Polysciences, Inc.	Przygotować do 1 mg/ml w wodzie. Dostosuj do pH 7,0 za pomocą 1 M HCl (roztwór staje się klarowny) i sterylizuj filtrem za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze -80oC do momentu użycia.
OptiPro SFM	Numer katalogowy: 12309-050	Technologie życiowe	Pożywki bez surowicy opracowane przez transfekcję
Roztwór higromycyny B	ANT-HG-1	Badania Jomar Life
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	AJA2225	Thermo Fisher Naukowy
Trypton (pepton kazeinowy)	LP0042B	Thermo Fisher Naukowy	Przygotuj do 20% w PBS i sterylizuj filtrem za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4oC.
System BLItz	45-5000	fortéBIO	Przyrząd służący do pomiarów interferometrii biowarstwowej (BLI).

powiedział: szt.