Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie cewnika przed operacją stereotaktyczną
- Wytnij cewniki PE50 (o długości 6 cm), które będą używane do łączenia kaniuli z pompami osmotycznymi (patrz rysunek 1). Napełnij cewniki PE50 sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) i uszczelnij oba końce cewników. Cewnik należy utrzymywać w temperaturze 4°C do czasu użycia.
2. Implantacja kaniuli metodą stereotaksji
- Operację należy wykonać w sterylnych warunkach. Wysterylizuj wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne przez autoklawowanie. Dokładnie wyczyść aparat stereotaktyczny i obszar roboczy i zdezynfekuj 70% roztworem etanolu. Noś maskę chirurgiczną, czepek do włosów i sterylne rękawiczki.
- Znieczulenie szczurów należy poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) roztworu ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 100 mg/kg i 10 mg/kg). Potwierdź znieczulenie, sprawdzając ruch po delikatnym uszczypnięciu palca
.
- Niesteroidowy lek przeciwzapalny (meloksykam; 1 mg/kg) należy wstrzyknąć podskórnie (s.c.) znieczulonemu zwierzęciu co najmniej 30 minut przed zabiegiem.
- Ogolić głowę zwierzęcia za pomocą maszynki do strzyżenia i trzykrotnie zdezynfekować skórę roztworem glukonianu chlorheksydyny 2% i alkoholu izopropylowego 2%. Nałóż weterynaryjną maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
- Umieść zwierzę na ramie stereotaktycznej z nausznikami. Zamocuj jedną kaniulę na ramieniu uchwytu ramy stereotaktycznej. Wstrzyknąć (podskórnie) środek znieczulający miejscowo (bupiwakaina (1,5 mg/kg) i lidokaina (1,5 mg/kg) w czubek głowy. Znieczulenie jest utrzymywane podczas całego zabiegu poprzez założenie stożka nosowego dostarczającego 3% izofluranu. Całe pole operacyjne powinno być zasłonięte, ale nie zrobiono tego tutaj, aby lepiej zademonstrować technikę.
- Wykonaj nacięcie o długości 3 cm na czubku głowy za pomocą skalpela. Zamontuj 4 zaciski wokół nacięcia, aby czaszka była czysta. Za pomocą nożyczek z okrągłą końcówką zrób kieszeń (2 x 2 cm2) pod skórą między łopatkami zwierzęcia.
- Zeskrob okostną czaszki ostrzem. Przyłóż gazik do czaszki, jeśli krwawi.
- Sprawdź, czy czaszka jest płaska i dobrze wyrównana na ramie stereotaktycznej. Aby upewnić się, że czaszka jest płaska, sprawdź współrzędne wysokości na bregmie i lambdzie. Weź współrzędne bregma, które będą używane jako punkt odniesienia.
- Zaczynając od bregmy, oblicz współrzędne dwóch kaniul prowadzących, które zostaną wszczepione obustronnie w hipokampie (przednio-tylna: - 0,42 cm; przyśrodkowo-boczna: ± 0,30 cm; grzbietowo-brzuszna: - 0,28 cm zgodnie z atlasem mózgu szczura Paxinosa i Watsona). Wskaż położenie kaniuli za pomocą markera.
- Wywierć otwór (0,5 mm) w czaszce w miejscu implantacji obu kaniul. Wywierć dwa inne otwory około 5 mm powyżej i poniżej tych punktów, aby włożyć, które zestalą kaniulę podczas nakładania cementu dentystycznego.
- Odetnij skalpelem jeden koniec cewnika wypełnionego wcześniej płynem mózgowo-rdzeniowym i włóż go w ramię kątowe kaniuli. Zamocuj pierwszą kaniulę za pomocą cementu dentystycznego. Unikaj umieszczania cementu dentystycznego wokół pozycji na drugiej kaniuli.
- Pozostaw cement dentystyczny do wyschnięcia na 2-3 minuty, a następnie zdejmij ramię uchwytu z pierwszej kaniuli i zamocuj w niej drugą kaniulę. Powtórz kroki 2.11 i 2.12. Umieść atrapę kaniuli na obu kaniulach prowadzących. Upewnij się, że manekin i kaniula prowadząca mają tę samą długość, aby zapobiec infiltracji tkanek i zablokowaniu kaniuli.
- Włożyć wolny koniec obu cewników do kieszeni utworzonej wcześniej między łopatkami zwierzęcia. Zdejmij zaciski i zszyj skórę nicią do szwów 4-0,
nuta: Górna kaniula prowadząca musi być dostępna dla nadchodzących infuzji Aβo.
- Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i umieść je z powrotem w klatce. Podczas rekonwalescencji pooperacyjnej umieść klatkę na podgrzewającym kocu wodnym, aż zwierzę się obudzi. Klatka powinna być częściowo na podkładce, aby szczur mógł uciec przed ciepłem w razie potrzeby. Stale monitorować zwierzę, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
- Szczury należy zwrócić do obiektu dla zwierząt w celu rekonwalescencji po operacji przez 10 dni pod ścisłym nadzorem.
nuta: Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje. Meloksykam (1 mg/kg mc.) podaje się raz na dobę przez dwa dni po zabiegu chirurgicznym w celu leczenia bólu.
3. Instalacja pompy osmotycznej
- Na dzień przed montażem napełnić pompy osmotyczne przeciwciałem 6E10 (1 mg/ml; 100 μl) i przeciwciałem kontrolnym IgG1 (1 mg/ml; 100 μl) zgodnie z instrukcjami producenta w sterylnych warunkach. Pompki należy przechowywać przez noc w sterylnej wodzie destylowanej o temperaturze 37 °C, aby aktywować pompy.
- Znieczulij szczury izofluranem 3% w celu zainstalowania pomp osmotycznych (0,5 μl/h przez 7 dni). Ogol się między łopatkami i zdezynfekuj skórę roztworem glukonianu chlorheksydyny 2% i alkoholu izopropylowego 2%. Wykonaj nacięcie o długości 2 cm skalpelem między łopatkami, aby zlokalizować cewniki PE50 połączone z kaniulą prowadzącą.
- Odetnij koniec cewników PE50 zawierających cement dentystyczny za pomocą skalpela. Podłącz pompy osmotyczne do cewników PE50 i dodaj trochę cementu dentystycznego na złączu pompy i cewnika, aby zabezpieczyć połączenie.
- Zszyj szczelnie skórę nicią do szwów 4-0. Umieść zwierzę z powrotem w klatce na podgrzewanej poduszce wodnej. Obserwuj, jak zwierzę szybko budzi się po znieczuleniu izofluranem (około 5 min).
nuta: Zabieg trwa około 5 do 10 minut.
4. Napary Aβo u obudzonych i swobodnie poruszających się szczurów
- Przygotować roztwór Aβo (0,2 μg/μl). Pozostawić Aβo do dynamicznej i spontanicznej agregacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przed infuzją.
- Zainstalować dwie strzykawki o pojemności 10 μl na pompie infuzyjnej. Napełnić strzykawki 5 μl sterylnej wody destylowanej. Przyciąć skalpelem dwa cewniki PE50 do długości około 60 cm. Napełnij oba cewniki sterylną wodą destylowaną za pomocą strzykawek o pojemności 1 ml i igieł 21G.
- Strzykawki o pojemności 1 ml należy trzymać na jednym końcu cewnika, a drugi koniec podłączyć do strzykawek Hamiltona. Wyjąć strzykawki o pojemności 1 ml i sprawdzić, czy w cewnikach nie ma pęcherzyków powietrza.
- Wprowadzić kaniulę wewnętrzną na końcu cewników PE50. Używając sterylnej wody destylowanej, napełnij wewnętrzną kaniulę podłączoną do cewników PE50 do 1 μl na strzykawkach Hamiltona. Utworzyć pęcherzyk powietrza, odciągając tłoki do tyłu do 2 μl.
- Wymieszać roztwór Aβo, pipetując w górę i w dół, używając końcówki o minimalnej przyczepności. Unikaj tworzenia się pęcherzyków podczas mieszania. Napełnij obie kaniule wewnętrzne 1,5 μl roztworu Aβo, odciągając tłoki do 3,5 μl.
- Wykonaj linie markerem przed i za pęcherzykiem powietrza w obu cewnikach. Służy to jako punkt kontrolny dla trwającej infuzji. Do infuzji należy zbliżyć klatkę do pompy infuzyjnej i zdjąć jej pokrywę.
- Umieść szczura w przytulnym miejscu i mocno zeskrob ramię przytuliska wokół jego szyi, aby unieruchomić głowę szczura. Wyjmij atrapę kaniuli z dwóch kaniul prowadzących. Wprowadzić przygotowaną wcześniej kaniulę wewnętrzną do kaniuli prowadzącej. Sprawdź, czy są całkowicie włożone i dobrze przymocowane do podstawy kaniuli prowadzącej.
- Uwolnij szczura z przytułka i umieść go z powrotem w klatce, aby ograniczyć stres związany z rywalizacją. Należy uważnie monitorować, aby upewnić się, że cewniki nie skręcają się ze sobą, a infuzja jest wykonywana prawidłowo.
- Włączyć pompę infuzyjną. Wstrzyknąć 1 μl roztworu Aβo z szybkością 0,1 μl/min (10 min). Podczas infuzji należy sprawdzić, czy tłok strzykawki porusza się w zakresie od 3,5 μl do 2,5 μl i czy pęcherzyki powietrza w obu cewnikach PE50 poruszają się w sposób ciągły.
- Pozostaw wewnętrzną kaniulę na miejscu na kolejne 5 minut po infuzji, aby umożliwić skuteczną dyfuzję roztworu Aβo. Przyłóż szczura z powrotem do przytulenia, aby usunąć wewnętrzną kaniulę i zaślepioną kaniulę prowadzącą, aby zapobiec cofaniu się wstrzykniętego roztworu. Użyj atrapy kaniuli, która zatrzymuje się tuż przed ramieniem kątowym kaniuli. Umieść zwierzę z powrotem w klatce.
- Powtarzaj infuzję Aβo raz dziennie przez 6 kolejnych dni. Poddaj zwierzę eutanazji przez ścięcie.
