Test in vitro do pomiaru fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał za pomocą fagocytów

Streszczenie

Źródło: Powell, R. L., et al. Izolacja leukocytów z mleka matki do stosowania w testach fagocytozy komórkowej zależnych od przeciwciał celów HIV. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film demonstruje test do pomiaru fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCP) przez fagocyty mleka matki. Znakowane fluorescencyjnie mikrosfery sprzężone z kompleksem antygen-przeciwciało są łączone z zawiesiną komórkową wyizolowaną z mleka matki w celu wywołania zależnej od przeciwciał fagocytozy komórkowej przez leukocyty fagocytarne. Po znakowaniu komórek przeciwciałami przeciwko powszechnemu antygenowi leukocytarnemu (CD45), cytometria przepływowa służy do pomiaru intensywności fluorescencji mikrosferycznie dodatnich żywotnych leukocytów fagocytarnych, wskazując poziom aktywności ADCP.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Przygotowanie docelowej mikrosfery

1. Wybierz odpowiedni antygen docelowy.
   nuta: W tym przykładzie użyto rekombinowanego białka V1V2-2F5K, które zostało zaprojektowane tak, aby naśladować trimeryczny wierzchołek natywnej otoczki HIV.
2. Wykonaj biotynylację za pomocą komercyjnego zestawu (Tabela Materiałów) zgodnie z protokołem producenta.
   1. Obliczyć mmol odczynnika biotyny, który należy dodać do reakcji dla 5-krotnego nadmiaru molowego, korzystają....

Wyniki

Rycina 1: Dane z cytometrii przepływowej próbki komórek wyizolowanych z mleka matki. Komórki zostały przetworzone i wybarwione zgodnie z opisem w protokole. (A) Pojedyncze komórki zostały bramkowane w celu wyeliminowania dubletów na wykresie FSC-H vs. FSC-A, jak pokazano, również wyprowadzając małe szczątki <5,000 w FSC-A. (B) Populację tę wykorzystano do bramowa.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 μm FluoSpheres Mikrosfery znakowane neutrawidyną	Rybak termiczny	F8776
BD Pharmingen PE Mysz anty-ludzka CD45	Bd	560975
Surowica bydlęca Albumina	MP Biomedycyna	8810025
Corning V-bottom polistyrenowy 96-dołkowy talerz	Corning	3894
Cytochalazyna D	Sigma	22144-77-0
Zestaw EZ-Link NHS-LC-LC-Biotyna	Rybak termiczny	Numer katalogowy: 21338
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 ml	Corning	352196
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml	Corning	Numer katalogowy: 352070
Możliwa do naprawienia Bejca 450	Bd	562247
Roztwór formaldehydu	Sigma	252549
HBSS bez czerwieni wapniowej, magnezowej i fenolowej	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 14175-095
Ludzki blok BD Fc	Bd	564219
Albumina surowicy ludzkiej	MP Biomedycyna	2191349
Kimtech Science Kimwipes Delikatne wycieraczki zadaniowe	Kimberly-Clark Profesjonalistka	Numer katalogowy: 34120
PBS 1x pH 7,4	Rybak termiczny	10010023
Polistyrenowe pipety serologiczne 10 ml	Corning	Numer katalogowy: 4488
Koncentratory białka PES, 3K MWCO, 0,5 ml	przebijać	Numer katalogowy: 88512

powiedział: SZT. TGL