Procedura końcówki STAGE do odsalania i oczyszczania peptydów

Streszczenie

Ten film pokazuje oczyszczanie peptydów za pomocą procedury STAGE Tip. Miniaturowa kolumna zawierająca kulki żywicy połączone z długimi łańcuchami węglowodorowymi ułatwia oczyszczanie oparte na oddziaływaniach hydrofobowych. Po załadowaniu wstępnie strawionej próbki peptydu do kolumny, fragmenty peptydu wiążą się z kulkami żywicy, umożliwiając przejście zanieczyszczeń. W celu elucji fragmentów peptydu stosuje się bufor elucyjny, który zakłóca oddziaływanie hydrofobowe.

Protokół

1. Oczyszczanie i odsalanie peptydów

1. Umieść trzy warstwy żywicy C18 w końcówce pipety o pojemności 200 μl dla każdej próbki peptydu, aby skonstruować końcówkę do ekstrakcji STop And Go (STAGE).
2. Dodać 1:10 roztwór zatrzymujący (20% acetonitrylu [ACN)] i 6% kwasu trifluorooctowego [TFA]) do próbek.
3. Odwirować próbki do wytrącania granulek przy 13 200 obr./min przez 10 min.
4. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 2 ml i wyrzucić osad.
5. Umyj końcówki za pomocą 100 μl 100% ACN.
6. Odwirować końcówki STAGE przy 1000 x g przez 2 min.
   nuta: Odwiruj końcówki STAGE, aż cała ciecz przepłynie przez żywicę C18.
7. Umyj końcówki STAGE 50 μl buforu B (80% ACN, 0,5% kwasu octowego i ddH₂O).
8. Odwirować końcówki STAGE o gramaturze 1000 x g przez 2 min.
9. Umyj końcówki STAGE 200 μl buforu A (2% ACN, 0,1% TFA, 0,5% kwasu octowego i ddH₂O).
10. Końcówki do odwirowania przy 1000 x g przez 2 min.
11. Załaduj próbki do końcówek STAGE.
12. Odwirować próbki o masie 1000 x g przez 3-5 minut.
13. Umyj końcówki STAGE 200 μl buforu A.
14. Wirować przy 1000 x g przez 3-5 min.
15. Dodaj 50 μl buforu B do każdej końcówki STAGE
16. Za pomocą strzykawki eluować próbki zawierające bufor B do probówki z paskiem PCR o pojemności 0,2 ml.
17. Po elucji próbek suszyć peptydy za pomocą wirówki próżniowej przez 45 minut.
18. Po wyschnięciu próbek należy je przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu wydania MS.
    nuta: Jeśli potrzebne jest przechowywanie peptydów przez więcej niż dwa tygodnie, sugerujemy przechowywanie w temperaturze -20°C.
19. Badać próbkę za pomocą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (MS).
    nuta: Parametry pomiaru próbki (np. ilość załadowanej próbki, długość gradientu chromatografii cieczowej, rozdzielczość) będą zależeć od zastosowanego oprzyrządowania.

2. Profilowanie proteomiczne neutrofili

1. Przetwarzanie danych surowych
   1. Prześlij pliki danych Raw uzyskane z MS do MaxQuant.
   2. Oprogramowanie zostało zaprojektowane do pracy z oddolnymi, zależnymi od danych plikami akwizycji, a wiele domyślnych parametrów jest zoptymalizowanych dla takich próbek. Parametry domyślne obejmują trawienie (trypsyna P), zmienne modyfikacje utleniania metioniny (utlenianie (M)) i N-acetylację białek (acetyl (białko N-term)) oraz stałe modyfikacje karbamidometylacji cysteiny (karbamidometyl (C)).
   3. Korekty tych parametrów obejmują kwantyfikację bez znaczników (LFQ; ustaw minimalną liczbę współczynników na 1), dopasowanie między przebiegami (tj. włącz/wyłącz) oraz minimalną liczbę peptydów zidentyfikowanych na białko (zalecane ustawienie na 2).
   4. W parametrach globalnych zaimportuj plik FASTA w celu identyfikacji sekwencji. W tym eksperymencie wykorzystano plik FASTA Homo sapiens (Human) (UP000005640) z bazy danych Uniprot. nuta: Zapisać następujące informacje do celów ewidencji: ID organizmu = 9606; liczba białek = 79,740; Data pobrania pliku.
   5. Ustaw liczbę rdzeni komputera, które mają być używane do przetwarzania, a następnie wybierz pozycję Uruchom.
   6. Po zakończeniu MaxQuant zostanie wygenerowany "połączony" folder wraz z innymi plikami.
      nuta: Pozostałe pliki mogą być używane do identyfikacji peptydów, modyfikacji itp., a także mogą być potrzebne do przesłania pełnego zestawu danych do repozytoriów danych, w tym Proteome Xchange (PRIDE).
2. Analiza i wizualizacja danych w Perseuszu
   1. Prześlij plik "proteingroups.txt" do Perseusa i wybierz wszystkie pliki intensywności LFQ dla okna "Głównego".
      nuta: Informacje o linii bazowej są importowane bezpośrednio do okien Perseusa, ale inne informacje (np. miejsca modyfikacji) mogą wymagać ręcznego dodania.
   2. Filtruj wiersze, usuwając zanieczyszczenia, peptydy odwrotne i peptydy zidentyfikowane tylko przez miejsce.
   3. Przekształć dane za pomocą logu₂(x).
   4. Aby zaobserwować liczbę białek wykrytych w każdej kontrpróbie, należy skonstruować numeryczny diagram Venna.
   5. Ustawianie adnotacji kategorii dla każdej próbki.
      nuta: Do celów statystycznych wszystkie powtórzenia jednej próbki biologicznej powinny mieć tę samą nazwę.
   6. Filtruj wiersze na podstawie prawidłowych wartości, z białkiem zidentyfikowanym w >50% kontrprób i w co najmniej jednej grupie.
      nuta: Filtrowanie według prawidłowych wartości może być bardziej rygorystyczne, w zależności od konfiguracji i celów eksperymentu (np. białko musi być obecne we wszystkich próbkach).
   7. Aby zastąpić brakujące wartości LFQ, można przeprowadzić imputację z rozkładu normalnego.
      UWAGA: parametry domyślne są zoptymalizowane pod kątem danych LFQ, ale można je dowolnie dostosowywać.
   8. Dodaj informacje o adnotacjach do wierszy białek. Dodaj plik txt.gz FASTA (uzyskany ze strony internetowej Perseus) w folderach 'bin', 'conf' i 'annotation' i wprowadź określone terminy (np. nazwy białek, nazwy genów, ontologię genów).
   9. Macierz jest teraz kompletna i może być wykorzystana do testów statystycznych (np. ANOVA, testy t) w celu określenia znaczących zmian w obfitości białek między badanymi warunkami. Inne formy narzędzi do wizualizacji obejmują wykresy analizy głównych składowych, mapy cieplne i wzbogacanie kategorii.
      nuta: Informacje o adnotacjach można również pobrać z UniProt i zintegrować z frameworkiem Perseus.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tubka Falcon 15 ml	Firma VWR	Numer telefonu 470225-000
25 ml Leki serologiczne	Fisher Naukowy	14955235
Wodorowęglan amonu (ABC)	ThermoFisher Naukowy	A643-500
kwas octowy	Sigma Aldrich	1099510001
aceton	Sigma Aldrich	34850-1L
Acetonitryl (ACN), klasa MS	przebijać	TS-51101
Zestaw testowy BSA	Firma VWR	CA62408-940
Dyski C18 (końcówki STAGE)	Fisher Naukowy	13110019
Wirówka 5810 R	Sigma Aldrich	EP022628188
Ditiotreitol (DTT)	ThermoFisher Naukowy	Czynnik R0861	Przygotuj 1 mln zapasów porcji naziemnej telewizji cyfrowej i przechowuj w temperaturze -20°C
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	ThermoFisher Naukowy	12483020	Rozmrozić, przygotować porcje i przechowywać w temperaturze -20°C
HEPESY	Sigma Aldrich	H3375	Przygotować porcje 8M mocznika/40 m HEPES, przechowywać w temperaturze -20 °C
Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości	ThermoFisher Naukowy	726042
Jodoacetamid (IAA)	Fisher Naukowy	AAA1471514	Przygotować 0,55 mln zapasów porcji IAA i przechowywać w temperaturze -20°C. Unikać ekspozycji na światło
L-glutamina	Fisher Naukowy	25030081	Rozmrozić, przygotować porcje i przechowywać w temperaturze -20°C
Probówki do mikrowirówek LoBind	Eppendorf	13-698-794
Maksymalna ilość	https://www.maxquant.org/
Probówki paskowe do PCR	Firma VWR	Nr kat. 76318-802
Penicylina Streptomycyna, Amfoterycyna	Sigma Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5955	Rozmrozić, przygotować porcje i przechowywać w temperaturze -20°C
Perseusz	https://www.maxquant.org/Perseus/
Roztwór buforowany fosforanami (PBS)	Sklep biologiczny	PBS408	Przechowywać w temperaturze pokojowej
Sonda soniczna	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 100-132-894
Tabletka z koktajlem inhibitorów proteazy ()	Sigma Aldrich	5892791001	Przechowywać w temperaturze 4°C
Silnik RPMI 1640	ThermoFisher Naukowy	11875093	Przechowywać w temperaturze 4°C
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	ThermoFisher Naukowy	J18220. Klasa A1	przygotować 2% roztwór SDS
Wirówka SpeedVac	Eppendorf	07-748-15
Wirówka do wywrotu STAGE	Brzmienie	STC-V2
Kolby T75	ThermoFisher Naukowy	156499
Kwas trifluorooctowy	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 85183
Tris HCL pH 8,5	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP152-1	Przechowywać w temperaturze 4°C
Trypsyna/Liza	Thermo Fisher Naukowy	A40009 (wersja	podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20°C
Kąpiel ultradźwiękowa	Firma VWR	Numer katalogowy: 97043-960
mocznik	Sklep biologiczny	URE001.1

powiedział: TGL powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: (wersja 2) angielska)