Procedura końcówki STAGE do odsalania i oczyszczania peptydów

1. Oczyszczanie i odsalanie peptydów

1. Umieść trzy warstwy żywicy C18 w końcówce pipety o pojemności 200 μl dla każdej próbki peptydu, aby skonstruować końcówkę do ekstrakcji STop And Go (STAGE).
2. Dodać 1:10 roztwór zatrzymujący (20% acetonitrylu [ACN)] i 6% kwasu trifluorooctowego [TFA]) do próbek.
3. Odwirować próbki do wytrącania granulek przy 13 200 obr./min przez 10 min.
4. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 2 ml i wyrzucić osad.
5. Umyj końcówki za pomocą 100 μl 100% ACN.
6. Odwirować końcówki STAGE przy 1000 x g przez 2 min.
   nuta: Odwiruj końcówki STAGE, aż cała ciecz przepłynie przez żywicę C18.
7. Umyj końcówki STAGE 50 μl buforu B (80% ACN, 0,5% kwasu octowego i ddH₂O).
8. Odwirować końcówki STAGE o gramaturze 1000 x g przez 2 min.
9. Umyj końcówki STAGE 200 μl buforu A (2% ACN, 0,1% TFA, 0,5% kwasu octowego i ddH₂O).
10. Końcówki do odwirowania przy 1000 x g przez 2 min.
11. Załaduj próbki do końcówek STAGE.
12. Odwirować próbki o masie 1000 x g przez 3-5 minut.
13. Umyj końcówki STAGE 200 μl buforu A.
14. Wirować przy 1000 x g przez 3-5 min.
15. Dodaj 50 μl buforu B do każdej końcówki STAGE
16. Za pomocą strzykawki eluować próbki zawierające bufor B do probówki z paskiem PCR o pojemności 0,2 ml.
17. Po elucji próbek suszyć peptydy za pomocą wirówki próżniowej przez 45 minut.
18. Po wyschnięciu próbek należy je przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu wydania MS.
    nuta: Jeśli potrzebne jest przechowywanie peptydów przez więcej niż dwa tygodnie, sugerujemy przechowywanie w temperaturze -20°C.
19. Badać próbkę za pomocą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (MS).
    nuta: Parametry pomiaru próbki (np. ilość załadowanej próbki, długość gradientu chromatografii cieczowej, rozdzielczość) będą zależeć od zastosowanego oprzyrządowania.

2. Profilowanie proteomiczne neutrofili

1. Przetwarzanie danych surowych
   1. Prześlij pliki danych Raw uzyskane z MS do MaxQuant.
   2. Oprogramowanie zostało zaprojektowane do pracy z oddolnymi, zależnymi od danych plikami akwizycji, a wiele domyślnych parametrów jest zoptymalizowanych dla takich próbek. Parametry domyślne obejmują trawienie (trypsyna P), zmienne modyfikacje utleniania metioniny (utlenianie (M)) i N-acetylację białek (acetyl (białko N-term)) oraz stałe modyfikacje karbamidometylacji cysteiny (karbamidometyl (C)).
   3. Korekty tych parametrów obejmują kwantyfikację bez znaczników (LFQ; ustaw minimalną liczbę współczynników na 1), dopasowanie między przebiegami (tj. włącz/wyłącz) oraz minimalną liczbę peptydów zidentyfikowanych na białko (zalecane ustawienie na 2).
   4. W parametrach globalnych zaimportuj plik FASTA w celu identyfikacji sekwencji. W tym eksperymencie wykorzystano plik FASTA Homo sapiens (Human) (UP000005640) z bazy danych Uniprot. nuta: Zapisać następujące informacje do celów ewidencji: ID organizmu = 9606; liczba białek = 79,740; Data pobrania pliku.
   5. Ustaw liczbę rdzeni komputera, które mają być używane do przetwarzania, a następnie wybierz pozycję Uruchom.
   6. Po zakończeniu MaxQuant zostanie wygenerowany "połączony" folder wraz z innymi plikami.
      nuta: Pozostałe pliki mogą być używane do identyfikacji peptydów, modyfikacji itp., a także mogą być potrzebne do przesłania pełnego zestawu danych do repozytoriów danych, w tym Proteome Xchange (PRIDE).
2. Analiza i wizualizacja danych w Perseuszu
   1. Prześlij plik "proteingroups.txt" do Perseusa i wybierz wszystkie pliki intensywności LFQ dla okna "Głównego".
      nuta: Informacje o linii bazowej są importowane bezpośrednio do okien Perseusa, ale inne informacje (np. miejsca modyfikacji) mogą wymagać ręcznego dodania.
   2. Filtruj wiersze, usuwając zanieczyszczenia, peptydy odwrotne i peptydy zidentyfikowane tylko przez miejsce.
   3. Przekształć dane za pomocą logu₂(x).
   4. Aby zaobserwować liczbę białek wykrytych w każdej kontrpróbie, należy skonstruować numeryczny diagram Venna.
   5. Ustawianie adnotacji kategorii dla każdej próbki.
      nuta: Do celów statystycznych wszystkie powtórzenia jednej próbki biologicznej powinny mieć tę samą nazwę.
   6. Filtruj wiersze na podstawie prawidłowych wartości, z białkiem zidentyfikowanym w >50% kontrprób i w co najmniej jednej grupie.
      nuta: Filtrowanie według prawidłowych wartości może być bardziej rygorystyczne, w zależności od konfiguracji i celów eksperymentu (np. białko musi być obecne we wszystkich próbkach).
   7. Aby zastąpić brakujące wartości LFQ, można przeprowadzić imputację z rozkładu normalnego.
      UWAGA: parametry domyślne są zoptymalizowane pod kątem danych LFQ, ale można je dowolnie dostosowywać.
   8. Dodaj informacje o adnotacjach do wierszy białek. Dodaj plik txt.gz FASTA (uzyskany ze strony internetowej Perseus) w folderach 'bin', 'conf' i 'annotation' i wprowadź określone terminy (np. nazwy białek, nazwy genów, ontologię genów).
   9. Macierz jest teraz kompletna i może być wykorzystana do testów statystycznych (np. ANOVA, testy t) w celu określenia znaczących zmian w obfitości białek między badanymi warunkami. Inne formy narzędzi do wizualizacji obejmują wykresy analizy głównych składowych, mapy cieplne i wzbogacanie kategorii.
      nuta: Informacje o adnotacjach można również pobrać z UniProt i zintegrować z frameworkiem Perseus.