Procedura końcówki STAGE do odsalania i oczyszczania peptydów

Streszczenie

Ten film pokazuje oczyszczanie peptydów za pomocą procedury STAGE Tip. Miniaturowa kolumna zawierająca kulki żywicy połączone z długimi łańcuchami węglowodorowymi ułatwia oczyszczanie oparte na oddziaływaniach hydrofobowych. Po załadowaniu wstępnie strawionej próbki peptydu do kolumny, fragmenty peptydu wiążą się z kulkami żywicy, umożliwiając przejście zanieczyszczeń. W celu elucji fragmentów peptydu stosuje się bufor elucyjny, który zakłóca oddziaływanie hydrofobowe.

Protokół

1. Oczyszczanie i odsalanie peptydów

1. Umieść trzy warstwy żywicy C18 w końcówce pipety o pojemności 200 μl dla każdej próbki peptydu, aby skonstruować końcówkę do ekstrakcji STop And Go (STAGE).
2. Dodać 1:10 roztwór zatrzymujący (20% acetonitrylu [ACN)] i 6% kwasu trifluorooctowego [TFA]) do próbek.
3. Odwirować próbki do wytrącania granulek przy 13 200 obr./min przez 10 min.
4. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 2 ml i wyrzucić osad.
5. Umyj końcówki za pomocą 100 μl 100% ACN.
6. Odwirować końcówki STAGE przy 1000 x g przez 2 min.
   nuta: Odwiruj końcówki ....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tubka Falcon 15 ml	Firma VWR	Numer telefonu 470225-000
25 ml Leki serologiczne	Fisher Naukowy	14955235
Wodorowęglan amonu (ABC)	ThermoFisher Naukowy	A643-500
kwas octowy	Sigma Aldrich	1099510001
aceton	Sigma Aldrich	34850-1L
Acetonitryl (ACN), klasa MS	przebijać	TS-51101
Zestaw testowy BSA	Firma VWR	CA62408-940
Dyski C18 (końcówki STAGE)	Fisher Naukowy	13110019
Wirówka 5810 R	Sigma Aldrich	EP022628188
Ditiotreitol (DTT)	ThermoFisher Naukowy	Czynnik R0861	Przygotuj 1 mln zapasów porcji naziemnej telewizji cyfrowej i przechowuj w temperaturze -20°C
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	ThermoFisher Naukowy	12483020	Rozmrozić, przygotować porcje i przechowywać w temperaturze -20°C
HEPESY	Sigma Aldrich	H3375	Przygotować porcje 8M mocznika/40 m HEPES, przechowywać w temperaturze -20 °C
Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości	ThermoFisher Naukowy	726042
Jodoacetamid (IAA)	Fisher Naukowy	AAA1471514	Przygotować 0,55 mln zapasów porcji IAA i przechowywać w temperaturze -20°C. Unikać ekspozycji na światło
L-glutamina	Fisher Naukowy	25030081	Rozmrozić, przygotować porcje i przechowywać w temperaturze -20°C
Probówki do mikrowirówek LoBind	Eppendorf	13-698-794
Maksymalna ilość	https://www.maxquant.org/
Probówki paskowe do PCR	Firma VWR	Nr kat. 76318-802
Penicylina Streptomycyna, Amfoterycyna	Sigma Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5955	Rozmrozić, przygotować porcje i przechowywać w temperaturze -20°C
Perseusz	https://www.maxquant.org/Perseus/
Roztwór buforowany fosforanami (PBS)	Sklep biologiczny	PBS408	Przechowywać w temperaturze pokojowej
Sonda soniczna	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 100-132-894
Tabletka z koktajlem inhibitorów proteazy ()	Sigma Aldrich	5892791001	Przechowywać w temperaturze 4°C
Silnik RPMI 1640	ThermoFisher Naukowy	11875093	Przechowywać w temperaturze 4°C
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	ThermoFisher Naukowy	J18220. Klasa A1	przygotować 2% roztwór SDS
Wirówka SpeedVac	Eppendorf	07-748-15
Wirówka do wywrotu STAGE	Brzmienie	STC-V2
Kolby T75	ThermoFisher Naukowy	156499
Kwas trifluorooctowy	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 85183
Tris HCL pH 8,5	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP152-1	Przechowywać w temperaturze 4°C
Trypsyna/Liza	Thermo Fisher Naukowy	A40009 (wersja	podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20°C
Kąpiel ultradźwiękowa	Firma VWR	Numer katalogowy: 97043-960
mocznik	Sklep biologiczny	URE001.1

powiedział: TGL powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: (wersja 2) angielska)