Testy do jakościowej i ilościowej oceny stężeń glukozy w moczu myszy

Streszczenie

Ten film demonstruje procedurę zbierania moczu myszy i oceny jej poziomu glukozy. Aby ocenić poziom glukozy, zanurz pasek testowy pokryty enzymami i barwnikiem chromogennym w próbce, inicjując zmianę koloru, która wskazuje poziom glukozy. W celu ilościowego określenia poziomu glukozy w moczu należy wprowadzić próbkę moczu do płytki wielodołkowej z rosnącymi stężeniami glukozy, dodać mieszaninę reakcyjną i inkubować. Zmierz absorbancję, aby utworzyć krzywą wzorcową i oblicz poziomy glukozy na podstawie absorbancji próbki.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Punktowe badanie stężenia glukozy w moczu

1. Umieść kawałek czystego Parafilmu na płaskiej powierzchni.
2. Delikatnie podnieś mysz za ogon i umieść ją na Parafilmie.
3. Przytrzymaj mysz za kark za pomocą kciuka i palca wskazującego. Delikatnie podnieś mysz, będąc skrępowaną przy karku, powodując oddawanie moczu przez mysz w odpowiedzi na stres. Pozwól, aby kropla moczu spadła na powierzchnię parafilmu. Przywróć mysz do klatki po zebraniu kropli moczu.
4. Zanurz końcówkę odczynnika paska Diastix w świeżej kropli moczu zebranej na powierzchni Parafilmu. Natychmiast usuń pasek i połóż go płasko na powierzchni kolorową stroną do góry. Odczekaj co najmniej 30 sekund, aż kolor całkowicie rozwinie się na pasku. Porównaj rozwinięty kolor z tabelą referencyjną znajdującą się na pojemniku Diastix (Rysunek 1).
   Porady: Jeśli mysz nie oddaje moczu na Parafilm, delikatnie uciskaj dolną część brzucha myszy (wokół pęcherza moczowego) za pomocą palca wskazującego. Takie podejście pomoże uwolnić krople moczu na parafilm. W przypadku myszy, które nie oddają moczu po wykonaniu procedury opisanej powyżej, odczekaj 20 minut i ponownie rozpocznij procedurę. Upewnij się, że wszystkie procedury są wykonywane zgodnie z wytycznymi IACUC.

2. Zbieranie moczu przez 24 godziny za pomocą mysiej klatki metabolicznej

1. Zmontuj klatkę metaboliczną Tecniplast (Rysunek 2) zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Napełnij zespół paszy sproszkowaną karwą, a następnie przymocuj zespół paszy do odpowiedniej metalowej wypustki w górnej komorze.
3. Przymocuj wspornik butelki z wodą do pozostałej metalowej wypustki w górnej komorze.
4. Napełnij pustą butelkę na wodę, a następnie wsuń ją do wspornika butelki, upewniając się, że rurka spijacza znajduje się w otworze.
5. Umieść mysz w klatce metabolicznej, a następnie przykryj ją pokrywką.
6. Upewnij się, że pokrywa klatki jest prawidłowo założona.
7. Umieść probówkę do zbierania moczu i rurkę do zbierania kału w odpowiednich miejscach na podłodze dolnej komory.
8. Po 24 godzinach wyjmij probówkę do zbierania moczu i wykonaj test glukozy w celu określenia stężenia glukozy w moczu. Jeśli test glukozy nie zostanie wykonany tego samego dnia, próbkę moczu należy zamrozić w zamrażarce w temperaturze -80°C.

3. Oznaczanie stężenia glukozy w moczu po 24 godzinach

1. Jeśli próbka moczu jest przechowywana w temperaturze -80°C, poczekaj, aż próbka się rozmrozi przed wykonaniem testu glukozy.
2. Z zapasu 100 mg / dl przygotuj osiem wzorców w zakresie od 25 mg / dl do 0 mg / dl zgodnie ze wskazówkami zestawu testowego.
3. Przygotuj standardowe studzienki i studzienki na próbki moczu na 96-dołkowej płytce, wszystkie w dwóch egzemplarzach, zgodnie z instrukcją zestawu.
4. Po rozpoczęciu reakcji poprzez dodanie zalecanej ilości mieszaniny enzymów do wszystkich studzienek, przykryć płytkę i pozostawić do inkubacji przez 10 minut w temperaturze 37°C.
5. Odczytać absorbancję przy 500-520 nm za pomocą czytnika płytek.
6. Przeanalizuj dane zgodnie z instrukcjami zestawu testowego. Wykreśl absorbancję każdego wzorca w stosunku do stężenia glukozy i użyj wykresu, aby określić stężenie glukozy w 24-godzinnej próbce moczu.

Wyniki

Rysunek 1. Punktowe badanie stężenia glukozy w moczu. Krople moczu myszy zebrane na Parafilm i tabela referencyjna kolorów znajdująca się na pojemniku Diastix.

Rysunek 2. Klatka metaboliczna Tecniplast do 24-godzinnego zbierania moczu myszy.<...