UWAGA: Poniższy protokół opisuje niezbędne kroki do eliminacji określonych komórek za pomocą fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni (NIR-PIT). Kontrole i inne szczegóły dotyczące NIR-PIT i żywotności komórek można znaleźć w innym miejscu.
1. Koniugacja podczerwieni 700 (IR700) z przeciwciałami monoklonalnymi (mAb)
- Przygotować interesujące nas mAb w stężeniu 2-5 mg/ml w 0,1 M roztworze wodorofosforanu disodowego (Na2HPO4) (pH 8,6).
- Zmieszać 6,8 nmol mAb z 30,8 nmol 10 mM IR700 w roztworze 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,6) w probówce mikrowirówkowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, przykryte folią aluminiową.
- Przemyć kolumnę PD-10 (patrz Tabela materiałów/wyposażenia) dwukrotnie 15 ml PBS. Załaduj próbkę z kroku 1.2.
- Oczyścić mieszaninę za pomocą kolumny PD-10 przez elucję PBS zgodnie z instrukcjami producenta.
UWAGA: W tym przypadku elucja przebiegała wzdłuż koloru pasma IR700. W przypadku próbki o objętości 300 μl frakcja elucyjna PBS wynosi zwykle od 2,5 ml do 4,4 ml.
- Oznaczyć stężenie białka za pomocą barwienia Coomassie, mierząc absorpcję przy długości fali 595 nm za pomocą spektrofotometru. Określić stężenie IR700 z absorpcją przy 689 nm, aby potwierdzić liczbę cząsteczek fluoroforu sprzężonych z każdą cząsteczką mAb.
UWAGA: Ważne jest, aby określić optymalną liczbę koniugacji cząsteczek IR700 w 1 mAb za pomocą spektrofotometru. Ogólnie rzecz biorąc, około 3 cząsteczki IR700 w 1 cząsteczce mAb są optymalne zarówno do pracy in vitro, jak i in vivo. Metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) można zastosować w celu potwierdzenia, czy mAb i IR700 są związane, czy nie.
- Przechowywać w temperaturze 4 °C po oznaczeniu stężenia białka.
2. Przygotowanie mieszanej hodowli komórkowej 3D (Mieszana sferoida)
- Nanieś sterylną wodę (około 1 ml) do części zbiornika na płytki wiszących płytek.
- Przygotuj różne proporcje interesujących typów komórek - komórki białka fluorescencyjnego A431-lucyferazy (A431-luc-GFP) i komórki białka 3T3-czerwonej fluorescencji (3T3-RFP) - przy czym każda próbka zawiera łącznie 5000 komórek, zawieszonych w 50 μl pożywki hodowlanej.
UWAGA: Przygotuj proporcje 1:100, 10: 100, 25:100, 50:100 itd. typów komórek będących przedmiotem zainteresowania w pożywkach hodowlanych w zależności od typu komórki.
- Inkubować mieszankę przez 5-7 dni na 96-dołkowej wiszącej płytce kroplowej w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 2 dni. UWAGA: Aby precyzyjnie wykonać sferoidę 3D, należy delikatnie obchodzić się z płytką, ponieważ krople zawierające komórki łatwo odpadają przed utworzeniem kształtów 3D.
- Obserwuj morfologię i rozmiar sferoid za pomocą mikroskopu odwróconego jasnego pola przy powiększeniu 10X - 40X. UWAGA: Chociaż zależy to od typu komórek i wielkości wiszącej kropli, upewnij się, że średnica sferoidy wynosi około 400-600 μm po 7 dniach inkubacji w 96-dołkowej wiszącej płytce kroplowej.
3. In Vitro NIR-PIT dla mieszanej hodowli komórek 3D
- Zmienić pożywkę z wiszących płytek kroplowych na 10 μg/ml koniugat przeciwciało-fotoabsorber (APC) i inkubować przez 6 godzin w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla.
- Po 6 godzinach inkubacji przemyć sferoidę dwukrotnie świeżą pożywką hodowlaną (bez czerwieni fenolowej). Delikatnie przenieść sferoidę do naczynia o średnicy 50 mm ze szklanym dnem ze 100 μl świeżej pożywki hodowlanej wolnej od czerwieni fenolowej, używając sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 μl z odciętą końcówką. Umieść jedną sferoidę w każdym naczyniu.
- Obserwuj sferoidę za pomocą mikroskopu odwróconego jasnego pola, aby wykryć zmianę morfologii. Do obserwacji reporterów optycznych (np. GFP i RFP) należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego z następującymi ustawieniami filtra: GFP — filtr wzbudzenia 469 nm i filtr emisyjny 525 nm; RFP — filtr wzbudzenia 559 nm i filtr emisyjny 630 nm.
- Umieść diodę elektroluminescencyjną (LED) nad naczyniem ze szklanym dnem w celu naświetlania.
UWAGA: Sferoidy mogą być wystawione na działanie światła NIR zarówno pod mikroskopem, jak i w osłonie laminarnej.
- Zmierz gęstość mocy światła NIR za pomocą miernika mocy optycznej. Zgodnie z tym pomiarem, naświetlaj światło NIR za pomocą diod elektroluminescencyjnych (LED), które emitują światło o długości fali od 670 do 710 nm przy 2 J/cm2,
UWAGA: Światło LED może przeniknąć na maksymalną głębokość około 5 cali. Działanie cytotoksyczne NIR-PIT zależy tylko od danej energii, niezależnie od gęstości mocy i czasu ekspozycji.
- Po napromienieniu przenieść sferoidę na nową wiszącą płytkę kroplową z 50 μl świeżej pożywki hodowlanej i inkubować przez 1 dzień w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla.
- Delikatnie przenieść sferoidę do naczynia ze szklanym dnem ze 100 μl świeżej pożywki hodowlanej (bez czerwieni fenolowej) za pomocą sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 μl z odciętą końcówką. Obserwuj sferoidę za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego 1 dzień po NIR-PIT, używając ustawień filtra opisanych w kroku 3.3.
- Wykryj martwe komórki, dodając jodek propidyny do pożywki w końcowym stężeniu 2 μg / ml lub przez utratę cytoplazmatycznej fluorescencji GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (ryc. 1B).
- Powtórz kroki 3.1-3.6, jeśli komórki docelowe nie zostaną całkowicie wyeliminowane.
