Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Formulacja i wybór urządzenia do wytwarzania aerozoli farmaceutycznych
UWAGA: Wybór formuły i urządzenia zależy od właściwości fizykochemicznych danego leku, który ma być aerozolowany.
- Aerozole ciekłe w nebulizacji.
- Rozpuść lek w 100 ml wody lub soli fizjologicznej.
- Załadować strzykawkę o pojemności 100 ml roztworem leku i umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej o natężeniu przepływu ustawionym na 1 ml/min.
- Podłączyć pompę strzykawkową do nebulizatora strumieniowego i usunąć powietrze z przewodu zasilającego prowadzącego do nebulizatora.
- Podłącz źródło sprężonego powietrza do nebulizatora strumieniowego i ustaw miernik przepływu powietrza na 10 l/min.
- Włóż nebulizator strumieniowy do separatora wstępnego. Separator wstępny łączy nebulizator z centralną komorą aerozolową urządzenia do inhalacji (rysunek 1).
UWAGA: Wiele związków leczniczych ma ograniczoną rozpuszczalność w wodzie i lepiej jest je formułować w postaci suchych aerozoli w postaci proszku. Jeśli stabilne zawieszenie można wykonać z mikronizowanego związku o medianie średnicy aerodynamicznej (MMAD < 5 μM), można je stosować z nebulizatorem strumieniowym. Należy zachować ostrożność, ponieważ zawiesina może zatkać nebulizator. Stężenia w nebulizatorze w paszy od 1 mg/ml dla silnych związków (takich jak ipratropium rozszerzający oskrzela) do 40 mg/ml zawiesin (dla słabszych związków, takich jak siarczan salbutamolu). Szybkość podawania pompy strzykawki jest ustawiona na 1 ml/min ze względów praktycznych: aby umożliwić zakończenie okresu równoważenia stężenia aerozolu i 45-minutowej ekspozycji bez konieczności ponownego ładowania strzykawki.
2. Konfiguracja eksperymentu z ekspozycją na aerozol
- Zmierzyć stężenie leku (poprzez zebranie aerozolu na filtrze absolutnym) i rozkład wielkości cząstek (poprzez zebranie aerozolu za pomocą impaktora kaskadowego) aerozolu, który dostaje się do jednostki inhalacyjnej po separatorze wstępnym/cyklonie. Wykorzystaj te parametry, minutową wentylację zwierzęcia, masę ciała i czas ekspozycji, aby oszacować dawkę leku zdeponowaną w płucach.
- Zważyć filtr bezwzględny i zapisać masę filtra. Umieść filtr w uchwycie filtra i zamontuj uchwyt filtra. Podłączyć wlot uchwytu filtra absolutnego do centralnego portu próbki komory aerozolowej, a wylot do źródła podciśnienia ustawionego na pobieranie próbki aerozolu z natężeniem przepływu 1 l/min na potrzeby eksperymentu.
UWAGA: Masa leku na filtrze po pobraniu próbki przez 45 minut może mieścić się w zakresie submikrogramów i/lub być zmieszana z laktozą, solą NaCl lub innym nośnikiem. Niezbędna jest mikrowaga z dokładnością do 0,1 mikrograma. Filtr musi być zrównoważony i zważony w środowisku o kontrolowanej wilgotności, aby uzyskać dokładną wagę leku osadzonego na filtrze. Masa leku na filtrach może być wykorzystana do obliczenia dawki tylko wtedy, gdy w postaci chemicznej nie ma nośnika lub nośnikiem jest woda. W przypadku gdy w postaci użytkowej znajduje się nośnik inny niż woda, masa substancji na filtrze stanowi jedynie szacunkowy punkt wyjścia do dalszej analizy zawartości leku za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
- Zważyć i zapisać masę 7 kaskadowych filtrów stopnia impaktora i jednego końcowego filtra "końcówki". Umieść filtr na każdym z siedmiu stopni impaktora kaskadowego i zmontuj impaktor kaskadowy Mercer. Podłączyć wlot impaktora kaskadowego do centralnego portu próbki komory aerozolowej, a wylot do źródła podciśnienia ustawionego na pobieranie próbek aerozolu przy natężeniu przepływu, przy jakim impaktor kaskadowy jest kalibrowany (zwykle 0,5 lub 1 l/min) na czas trwania eksperymentu.
- Monitoruj zawartość aerozolu w urządzeniu do inhalacji za pomocą monitora aerozolu w czasie rzeczywistym (patrz Tabela materiałów i odczynników), aby potwierdzić, że generatory aerozoli działają i wytwarzają stabilny aerozol przez cały czas trwania eksperymentu. Podłącz wlot monitora aerozolu w czasie rzeczywistym do centralnego portu próbki komory aerozolowej, a wylot do źródła podciśnienia ustawionego na pobieranie próbki aerozolu z natężeniem przepływu 1 l/min na potrzeby eksperymentu.
UWAGA: Sygnał monitorowania aerozolu w czasie rzeczywistym jest podawany w μg/l, ale jest skalibrowany dla pyłu drogowego i musi być ponownie skalibrowany dla każdego aerozolu leku, aby uzyskać prawidłowe wartości stężenia aerozolu. Kalibracja nie jest konieczna w przypadku korzystania z monitora w celu potwierdzenia obecności lub braku stężenia aerozolu oraz stabilności czasowej.
- Ustaw parametry sterowania procesem (przepływ powietrza, podciśnienie, ciśnienie, moc generatora aerozolu) na wymagane wartości, które zależą od liczby zwierząt podłączonych do jednostki inhalacyjnej. Jednostka inhalacyjna i generatory aerozoli są w sposób ciągły kontrolowane/monitorowane przez skomputeryzowany system kontroli/akwizycji danych procesu (DACO) dostarczony przez producenta (patrz Tabela materiałów i odczynników). Natężenie przepływu powietrza do urządzenia do inhalacji powinno być co najmniej około 2 razy większe niż całkowite minutowe tempo wentylacji wszystkich zwierząt w urządzeniu do inhalacji, aby uniknąć gromadzenia się CO2 .
- Załaduj myszy do ograniczników tylko do nosa przed wystawieniem ich na działanie aerozolu w urządzeniu do inhalacji tylko do nosa. Załaduj również zwierzęta do ograniczników, aby mogły oddychać powietrzem w pomieszczeniu.
UWAGA: Eksperyment dawka/odpowiedź składa się z wielu grup myszy wystawionych na działanie aerozolu przez różny czas. Czas ekspozycji kontroluje dawkę każdej grupy podczas eksperymentu dawka/odpowiedź.
- Ustaw rurkę krępującą w kierunku sufitu, próbując załadować zwierzęta, ponieważ mają one tendencję do biegania w górę, próbując uciec. Skierowanie rurek w dół podczas ładowania zachęci do odwrócenia się i ucieczki z tyłu rury. Upewnij się, że nos myszy jest skierowany w spiczasty koniec rurki i zamocuj tłok o zmiennym położeniu w tylnej części ogranicznika.
UWAGA: Tłok jest tak skonstruowany, aby ogon myszy wystawał z uchwytu, co umożliwia myszowi regulację temperatury ciała podczas przebywania w uchwycie.
- Wyreguluj tłok, aby myszy mogły się obracać, ale nie obracać się od głowy do ogona, aby zapewnić wdychanie aerozolu.
- Stale monitoruj myszy w rurkach krępujących. Po ustawieniu tłoka małe myszy (<20 gramów) często próbują obrócić się głową w ogon w rurkach i przyjąć pozycję U, w której mają problemy z oddychaniem. To zachowanie podczas skręcania jest najbardziej rozpowszechnione w ciągu pierwszych 5 minut powściągliwości; Po tym myszy rzadko próbują obrócić się od głowy do ogona.
3. Dostarczanie aerozolu
- Włóż korki, aby zatkać porty tłoczne jednostki inhalacyjnej i aktywować generator aerozolu, regulator przepływu sprężonego powietrza i pompę próżniową jednostki inhalacyjnej z poziomu oprogramowania sterującego procesem.
- Gdy odczyty z monitora aerozolu w czasie rzeczywistym wykażą, że stężenie aerozolu musi dojść do równowagi (~30 min, rysunek 2), zacznij wyjmować korki i wkładać do urządzenia do inhalacji rurki krępujące tylko nos, zawierające myszy. Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie myszy wystawione na działanie leku zostaną podłączone do urządzenia do inhalacji.
UWAGA: W przykładowym eksperymencie całkowity przepływ powietrza dostarczany do jednostki inhalacyjnej za pośrednictwem generatora aerozoli i powietrza rozcieńczającego jest ustawiony tak, aby zapewnić natężenie przepływu 0,5 l/min do każdego używanego portu narażenia zwierząt. Na przykład całkowity przepływ powietrza 15 l/min wystarcza do zasilania każdego z 30 portów w urządzeniu do inhalacji. Jest to znacznie większy przepływ powietrza niż wymaga tego minutowa wentylacja myszy, ale większy przepływ powietrza jest niezbędny do dostarczenia energii (spadek ciśnienia na generatorze aerozolu) w celu wytworzenia (atomizacji/deaglomeracji) aerozolu.
- Gdy wszystkie zwierzęta zostaną załadowane do jednostki naświetlania, włącz pompy do pobierania próbek próżniowych podłączone do filtra absolutnego i impaktora kaskadowego za pomocą oprogramowania sterującego procesem.
- Po zakończeniu wszystkich ekspozycji wyłącz generator aerozoli i wyjmij pozostałe myszy z urządzenia do inhalacji.
UWAGA: Zwierzęta będą obsługiwane w kapturze stanowiska do przewijania lub przez personel noszący maskę na twarz. Po zakończeniu podawania aerozolu myszy są wyjmowane z probówek i odkażane po każdym użyciu.
