Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie chirurgiczne, znieczulenie i schemat analgezji
- Umieść sterylną jednorazową serwetę (45,7 cm x 66 cm) na platformie operacyjnej. Delikatnie chwyć mysz, wstrzyknij ketaminę (50 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg) dootrzewnowo (i.p) w celu znieczulenia i wstrzyknij 0,05 mg/kg buprenorfiny podskórnie w celu znieczulenia.
- Upewnij się, że głębokość znieczulenia jest przez uszczypnięcie palca u nogi, ogol włosy w całym obszarze brzucha brzytwą i umieść mysz na sterylnej platformie chirurgicznej pod mikroskopem operacyjnym pod mikroskopem operacyjnym w powiększeniu 6-10x.
2. Żniwo śledziony dawcy
- Wysterylizuj brzuch wacikiem nasączonym alkoholem, zabezpiecz kończyny taśmą chirurgiczną i wykonaj nożyczkami pionowe nacięcie skóry w linii środkowej od łona do wyrostka mieczykowatego.
- Cofnij ścianę brzucha za pomocą sterylnych zwijaczy wykonanych ze spinaczy do papieru. Przesuń jelita na prawą stronę brzucha (lewą stronę chirurga) za pomocą sterylnego bawełnianego wacika, aby odsłonić śledzionę. Kauteryzuj krótką żyłę żołądkową przyczepioną do śledziony za pomocą sterylnego kauteryzacji w niskiej temperaturze (ryc. 1A). Umieść kawałek sterylnej gazy nasączonej solą fizjologiczną o temperaturze 37 °C na śledzionie, aby była wilgotna (ryc. 1B).
- Oddzielić i zmobilizować żyłę wrotną od tkanki trzustki (ryc. 1C) poprzez podwiązanie odgałęzień żyły wrotnej (żyła trzustkowo-dwunastnicza górna i prawa żyła żołądkowa); założyć szew wokół żyły wrotnej dystalnie od żyły śledziony (ryc. 1D).
- Odwróć śledzionę na prawą stronę, aby odsłonić aortę i pień trzewnej z tętnicą śledzionową (ryc. 1E). Wypreparować i zmobilizować tętnicę aortalno-celiakijno-śledzionową poprzez podwiązanie tętnicy wątrobowej i tętnicy żołądkowej; założyć szew wokół aorty proksymalnie do tętnicy trzewnej (ryc. 1F-G).
- Wstrzyknij 100 jednostek międzynarodowych (j.m.) heparyny do żyły głównej dolnej (IVC) w celu heparynizacji całego ciała i odczekaj 3 minuty, aby upewnić się, że heparyna zacznie działać. Podwiązać aortę proksymalnie do tętnicy trzewnej, przeciąć żyłę wrotną, a następnie przetoczyć całe ciało za pomocą 10 ml heparynizowanej zimnej (4 °C) soli fizjologicznej (10 ml / 20 s) z aorty brzusznej dystalnej do trzewnej tułowia (ryc. 1H).
- Pobrać przeszczep śledziony en bloc z powiązanym odcinkiem aortalno-celiakalnym i śledzionowym oraz żyłą wrotną wraz z odcinkiem żyły śledziony i niewielką częścią tkanki trzustki. Przed przeszczepem należy zachować przeszczep w 5 ml soli fizjologicznej o temperaturze 4 °C. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
3. Biorca splenektomii i implantacji przeszczepu śledziony
- Umieść poduszkę grzewczą na platformie operacyjnej i ustaw temperaturę na 37 °C. Umieść sterylną serwetkę (45.7 cm x 66 cm) na wierzchu poduszki grzewczej, aby stworzyć sterylną platformę chirurgiczną. Powtórz kroki 2.1 i 2.2 w celu przygotowania chirurgicznego i znieczulenia. Wykonaj nacięcie w linii środkowej o długości 3-4 cm i cofnij ścianę brzucha zgodnie z opisem w kroku 2.1 i kroku 2.2.
- Ostrożnie przesuń jelito na prawą stronę myszy za pomocą sterylnego wacika, aby odsłonić śledzionę biorcy. Podwiązać żyłę śledziony i tętnicę oraz usunąć śledzionę.
- Ostrożnie przesuń jelito na lewą stronę myszy i przykryj jelita mokrą gazą (nasączoną sterylną solą fizjologiczną o temperaturze 37 °C). Wypreparuj i podwiąż gałęzie lędźwiowe aorty podnerkowej i IVC; zacisnąć krzyżowo aortę podnerkową i IVC za pomocą dwóch zacisków mikronaczyniowych 4 mm.
- Umieść nylonowy szew 11-0 przez aortę podnerkową (o pełnej grubości) i wycofaj, aby utworzyć aortomię eliptyczną za pomocą jednego cięcia mikronożyczkami (długość powinna odpowiadać średnicy aorty dawczej, ryc. 2A). Przekłuć IVC za pomocą igły 30 G, aby utworzyć eliptyczną wenotomię i rozszerzyć otwór do długości dopasowanej do żyły wrotnej dawcy za pomocą mikronożyczek (ryc. 2A).
- Usunąć krew śródświateł lub skrzep krwi (w aorcie i IVC) za pomocą 500 μl heparynizowanej soli fizjologicznej (10 jednostek/ml).
- Umieść przeszczep śledziony w prawym boku brzucha myszy biorcy; dokładnie zidentyfikuj mankiet aortalny dawcy i żyłę wrotną dawcy. Po upewnieniu się, że naczynia nie są skręcone, przykryj przeszczep śledziony gazą nasączoną zimną (4 °C) solą fizjologiczną.
- Połącz mankiet aortalny dawcy z bliższym i dalszym wierzchołkiem aortaotomii biorcy za pomocą dwóch szwów podtrzymujących (szew nylonowy 11-0, taki sam jak poniżej) (ryc. 2B, C). Wykonać zespolenie z 2-3 kęsami ciągłych nylonowych szwów 11-0 między mankietem aortalnym dawcy a aortaotomią biorcy (ściana przednia) (ryc. 2D). Obrócić przeszczep śledziony na lewą stronę biorcy; wykonać zespolenie między mankietem aortalnym dawcy a aortomią biorcy (ściana tylna) (ryc. 2E).
- Wykonaj zespolenie, aby połączyć żyłę wrotną dawcy z tylną ścianą IVC biorcy, używając 4 do 5 kęsów ciągłych szwów po wewnętrznej stronie IVC, a następnie zamknij szew na zewnątrz IVC (ryc. 2F, G).
- Zwolnij zaciski naczynia i użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby tamponadować krwawienie, aż do odzyskania koloru śledziony (ryc. 2H).
- Zamknij brzuch syntetycznym wchłanialnym szwem vicryl 5-0 w sposób ciągły. Zamknij warstwę skóry nylonowym szwem 5-0 w przerywany wzór.
nuta: W przypadku kroków 3.7-3.8 alternatywnie należy najpierw wykonać zespolenie między żyłą wrotną dawcy a IVC biorcy (krok 3.8); Następnie wykonaj zespolenie między mankietem aorty dawcy a tylną ścianą aortomii biorcy, używając 2 do 3 ciągłych szwów po wewnętrznej stronie aorty i zamknij szew na zewnątrz aorty.
4. Odzyskiwanie zwierząt
- Wstrzyknąć 1 ml ciepłej soli fizjologicznej podskórnie przez 4 oddzielne miejsca (0,25 ml / lokalizację) po zamknięciu brzucha.
- Trzymaj mysz w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze (30 °C) przez pierwsze kilka godzin po operacji, monitoruj mysz do momentu odzyskania wystarczającej świadomości, a następnie przenieś mysz do nowej, czystej klatki ze zwykłym jedzeniem i wodą, z poduszką grzewczą (30 °C) pod klatką. Trzymaj mysz po operacji w osobnej klatce.
5. Leczenie bólu pooperacyjnego
- Wstrzyknąć 0,05 mg/kg buprenorfiny podskórnie 24 godziny i 48 godzin po zabiegu w celu utrzymania schematu przeciwbólowego.
