Generowanie rozległej demielinizacji kory mózgowej w modelu szczurzym

Streszczenie

Źródło: Üçal, M. et al., Rat Model rozległej demielinizacji kory mózgowej wywołanej domózgowym wstrzyknięciem cytokin prozapalnych. J. Vis. Exp. (2021)

Wideo demonstruje metodę generowania modelu szczura z rozległą demielinizacją kory mózgowej. Polega to na przerwaniu bariery krew-mózg poprzez wstrzyknięcie cytokin prozapalnych myszom pobudzonym rekombinowanym białkiem osłonki mielinowej. Proces ten ułatwia infiltrację komórek odpornościowych, co skutkuje powszechną demielinizacją kory mózgowej.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie materiału

UWAGA: Operacja przeprowadzana jest w warunkach aseptycznych. Przed rozpoczęciem upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne, w tym wiertła, są oczyszczone odpowiednim środkiem dezynfekującym.

1. Przygotować mieszaninę znieczulającą: 0,02 mg/ml fentanylu, 0,4 mg/ml midazolamu i 0,2 mg/ml medetomidyny (końcowe stężenia w mieszaninie).
   UWAGA: Zapoznaj się z odpowiednią sekcją Dyskusja, aby zapoznać się z alternatywnymi środkami znieczulającymi.
2. Przygotować mieszaninę antidotum: 0,07 mg/ml flumazenilu i 0,42 mg/ml atipamezolu (końcowe stężenia w mieszaninie).
3. Zamontuj cewnik i nasadkę cewnika z wlotem i śrubą. Przyciąć cewnik na długość 2 mm za pomocą skalpela (Rysunek 1).
   UWAGA: Nie używaj do tego nożyczek, ponieważ ściskają one i zniekształcają okrągły kształt przekroju końcówki cewnika.

2. Przygotowanie chirurgiczne

1. Znieczulić szczura poprzez dootrzewnowe podanie mieszaniny środka znieczulającego (1,5 ml/kg masy ciała).
2. Ogol głowę szczura między uszami za pomocą golarki elektrycznej. Umieść koc homeotermiczny na ramie stereotaktycznej przed ustawieniem zwierzęcia, aby uniknąć hipotermii podczas operacji.
3. Unieruchomić głowę szczura w ramie stereotaktycznej za pomocą nauszników i płytki zgryzowej, upewniając się, że głowa jest pozioma i stabilna. Sprawdź stabilność, wywierając nacisk na czaszkę palcem lub kleszczami.
   UWAGA: Luźne mocowanie i niepoziome ustawienie w ramie stereotaktycznej może spowodować odchylenie od zamierzonych współrzędnych.
4. Zastosuj nawilżające krople do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu. Zakryj oczy nieprzezroczystym materiałem, aby zapobiec ekspozycji na światło chirurgiczne.
5. Oczyść ogolone miejsce, stosując naprzemiennie 70% etanolu i 10% kompleksu powidon-jod.
   UWAGA: Przestrzegaj wszystkich środków ostrożności podczas zabiegu, aby uniknąć infekcji. Zabieg przeprowadzany jest w warunkach aseptycznych. Jeśli aseptyka zostanie przerwana, zanieczyszczony materiał musi zostać wymieniony.

3. Implantacja cewnika

1. Wykonaj podłużne nacięcie o długości około 2 cm na środku skóry głowy. Użyj zacisków buldoga, aby przytrzymać skórę na boki. Aby zapoznać się z omówieniem tych kroków, zobacz rysunek 2.
2. Usuń krew za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.
3. Usuń okostną czaszki. Oczyść tkankę za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i odsłoń kość czaszki. Pozostaw czaszkę do wyschnięcia na około 1 minutę.
4. Zidentyfikuj anatomiczne punkty orientacyjne, lambda, Bregma i szew przyśrodkowy. Po zamontowaniu wiertła na ramie stereotaktycznej, umieść końcówkę wiertła w Bregma jako punkt początkowy. Przesunąć się o 2 mm w tył od Bregmy i przesunąć ~2,4 mm w bok do szwu przyśrodkowego.
5. W tym miejscu wywierć otwór o średnicy 0,5 mm na cewnik. Delikatnie zdmuchnij pył kostny.
   UWAGA: Ważne jest, aby opona twarda pozostała nienaruszona podczas wiercenia. Aby to zapewnić, 1) użyj wiertła, które można zainstalować na ramie stereotaktycznej, 2) często sprawdzaj otwór podczas wiercenia i 3) wierc małymi krokami. Jeśli na czaszkę zostanie przyłożony zbyt duży nacisk, końcówka wiertła będzie nadal wchodzić w mózg i uszkadza go, gdy czaszka zostanie w pełni przebita.
6. Wywierć 3 kolejne otwory (o średnicy ~1,3 mm) na kotwiące w odległości kilku milimetrów od pierwszego otworu. Delikatnie zdmuchnij pył kostny.
   UWAGA: Wybierz miejsca kotwiących, które zapewniają wystarczająco dużo miejsca na górną część cewnika (o średnicy ~2 mm) i nakrętki kotwiące (~1 mm).
7. Usunąć pył kostny przez przepłukanie około 1 - 2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) lub soli fizjologicznej za pomocą strzykawki. Oczyść czaszkę. Dokręć kotwiące o 2-3 pełne obroty.
   UWAGA: kotwiące są niezbędne do ustabilizowania zestawu poprzez przytrzymanie cementu dentystycznego, a tym samym cewnika na miejscu. Podczas dokręcania kotwiącej upewnij się, że nie można jej łatwo wyjąć, delikatnie podnosząc ją do góry za pomocą kleszczy. Ponieważ samo wszczepienie cewnika powoduje uraz tkanki, dodatkowe uszkodzenie opony twardej podczas wiercenia lub dokręcania kotwiących doprowadzi do wielu urazów i może utrudnić porównywalność w grupie. Najpierw dokręć kotwiące, a na końcu włóż cewnik.
8. Wprowadzić cewnik o długości 2 mm przez pierwszy otwór, prostopadle do powierzchni czaszki. Trzymając cewnik w środku, nałóż niewielką ilość cementu dentystycznego i pozwól mu spolimeryzować po krótkiej (~5 s) ekspozycji na światło do utwardzania zębów, aby ustabilizować cewnik, umożliwiając użycie obu rąk w następnym kroku.
   ostrożność: Podczas pracy z lampą do utwardzania zębów należy unikać patrzenia bezpośrednio na końcówkę lub na światło odbite od obszaru aplikacji, ponieważ duże natężenie tego światła może spowodować uszkodzenie siatkówki. Używaj odpowiednich okularów ochronnych.
9. Nałóż więcej cementu dentystycznego wokół cewnika, zakotwicz i zestal cement dentystyczny za pomocą światła do utwardzania zębów (~15 - 30 s). Potwierdź twardnienie cementu końcówką kleszczy.

4. Zamykanie rany i antagonizacja znieczulenia

1. Zamknij skórę głowy za pomocą wchłanialnych szwów, z przodu i z tyłu cewnika.
   UWAGA: Ponieważ pod koniec implantacji nad czaszką pojawi się wyboiste ustawienie, należy odpowiednio zamknąć ranę. Zbyt mocne uniesienie skóry spowoduje dyskomfort dla zwierzęcia.
2. Mieszaninę antidotum należy wstrzyknąć podskórnie (1,5 ml/kg masy ciała) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o sile 26 g.
3. Enrofloksacynę (2,5%) należy podawać we wstrzyknięciu podskórnym (7,5 mg/kg masy ciała) w profilaktycznym leczeniu antybiotykami. Karprofen (1 mg/ml; 5 mg/kg masy ciała) i buprenorfina (1,2 mg/kg mc.) należy podawać w celu złagodzenia bólu we wstrzyknięciu podskórnym.

5. Opieka pooperacyjna i leki

1. Umieść zwierzę z powrotem w zmodyfikowanej klatce i trzymaj je pod obserwacją przez 1-3 godziny, stosując światło podczerwone, aby uniknąć hipotermii. Stale obserwuj i zmieniaj pozycję zwierzęcia co 5 do 10 minut, aż do rekonwalescencji pooperacyjnej. Zachowaj szczególną ostrożność, aby unikać stałej ekspozycji oczu na światło aż do rekonwalescencji.
2. Powtórzyć podawanie enrofloksacyny (7,5 mg/kg masy ciała) i karprofenu (1 mg/ml; 5 mg/kg masy ciała) we wstrzyknięciach podskórnych następnego dnia po zabiegu. Buprenorfina nie musi być odświeżana, ponieważ poprzednia kuracja jest skuteczna przez 72 godziny.

6. Przygotowanie mieszanki uodparniającej (najwcześniej 14 dni po wszczepieniu cewnika)

UWAGA: Umieść strzykawki na lodzie podczas procedury przygotowania.

1. Podłącz dwie szklane strzykawki Luer lock o pojemności 10 ml do krótkich ramion 3-kierunkowego kranu i zamknij trzeci wylot długim ramieniem.
2. Upewnij się, że połączenia są bezpieczne i szczelne: dodać około 4 ml sterylnego PBS do otwartej strzykawki, trzymając tłok 2. Włóż tłok 1 i popychaj oba tłoki do przodu ido tyłu, sprawdzając, czy nie ma wycieków. Jeśli nie wystąpi żaden wyciek, wyrzuć PBS i ponownie wyjmij tłok 1.
3. Pobrać razem pipetę 1 ml niekompletnego adiuwantu Freunda (IFA) i 50 μg rekombinowanej glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (rMOG_1-125) i dostosować mieszaninę do końcowej objętości 2 ml za pomocą sterylnego PBS (pH 7,4) w odpowiedniej probówce.
   UWAGA: Ze względu na ubytki emulsji na końcach lub ściankach strzykawek podczas przygotowania, należy przygotować większą objętość niż przeznaczona do podania. Podobnie praktyczne jest przygotowanie się na więcej niż 1 zwierzę na raz.
4. Umieścić rozcieńczoną mieszaninę IFA i rMOG_1-125 w otwartej strzykawce. Delikatnie włóż tłok, utrzymując luźny nacisk na przeciwległy tłok (Rysunek 3A).
5. Emulgować inokulum, przesuwając je z jednej strzykawki do drugiej, popychając tłoki w przód i w tył, aż stanie się białe i lepkie (Ryc. 3B).
6. Przymocuj strzykawkę Luer lock o pojemności 1 ml do otwartego krótkiego ramienia 3-kierunkowego zaworu odcinającego i napełnij ją inokulum (Rysunek 3C). Rozprowadź całe inokulum w strzykawkach o pojemności 1 ml. Lek należy przechowywać na lodzie do czasu wstrzyknięcia. Mieszaninę podawać w dniu przygotowania.

7. Szczepienia

ochronne

1. Znieczulić szczura izofluranem w komorze (~2 min, zmieszany z tlenem 2 l/min), a następnie podtrzymać znieczulenie przez maskę (zmieszaną z tlenem 1,5 l/min).
2. Wstrzyknąć 200 μl inokulum podskórnie u podstawy ogona za pomocą igły 21 G.
   UWAGA: Wstrzyknięcie należy powoli, ponieważ roztwór jest lepki.

8. Wstrzyknięcie cytokin domózgowych

1. Dostosuj długość kaniuli łącznika (2 mm). (Patrz rysunek 4, aby zapoznać się z krokami przygotowania).
2. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml mieszaniną cytokin (500 ng/μl czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-alfa), 300 U/μL rekombinowanego interferonu gamma szczura (IFN-gamma) w sterylnym PBS). Podłączyć strzykawkę do kaniuli łącznika. Napełnij kaniulę mieszaniną cytokin. Unikaj pęcherzyków.
3. Zamontuj strzykawkę na programowalnej pompie strzykawkowej i zaprogramuj ją tak, aby wstrzykiwała 0,2 μL/min (Rysunek 5A). Uruchom pompę i utrzymuj ją w ruchu, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza na końcu kaniuli.
   UWAGA: Prędkość wstrzykiwania musi uwzględniać średnicę wewnętrzną konkretnej używanej strzykawki; W związku z tym średnica strzykawki musi być zarejestrowana podczas ustawiania pompy.
4. Znieczulić szczura izofluranem w komorze (~2 min, zmieszane z 2 l/min tlenu), a następnie podtrzymać znieczulenie przez maskę (zmieszaną z 1,5 l/min tlenu) (ryc. 5B i 5C). Zastosuj nawilżające krople do oczu, ponieważ zwierzę będzie znieczulone przez co najmniej 30 minut.
5. Zdejmij nasadkę cewnika wraz z wlotem. Włóż kaniulę łącznika do cewnika, przykręć ją i dokręć (rysunki 5D i 5E).
   UWAGA: Nie dokręcaj go zbyt mocno, ponieważ spowoduje to zniszczenie górnej końcówki cewnika.
6. Pozostawić wstrzyknięcie na 10 minut (całkowita objętość wstrzyknięcia wynosi 2 μl). Zatrzymaj pompę. Pozostaw kaniulę wewnątrz cewnika na 20 minut, aby wstrzyknięta objętość mogła się całkowicie rozproszyć.
7. Odkręć kaniulę złącza i wyjmij ją powoli, aby uniknąć efektu podciśnienia.
8. Ponownie załóż nasadkę cewnika z wlotem i przykręć ją. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu w klatce.

Wyniki

Rycina 1: Przygotowanie cewnika. (A i B) Kaniula prowadząca i kaniula atrapa (nasadka cewnika z wlotem) są zmontowane i przykręcone. (C) Następnie cewnik jest przycinany do rozmiaru 2 mm za pomocą skalpela. Obserwacja mikroskopowa wykazała, że używanie w tym celu nożyczek zniekształca okrągły kształt końcówki kaniuli, a tym samym należy tego unikać....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dorosły samiec szczura Dark Agouti (300 ±25 g)
Fentanylu	Hameln pharma plus, Niemcy		Jako cytrynian fentanylu, 50 μg/ml
Midazolam	ERWO Pharma, Austria	50039017	5 mg/ml
Medetomidyna	Orion Pharma, Finlandia		Jako chlorowodorek medetomidyny, 1 mg/ml
Flumazenil (Flumazenil)	Roche, Szwajcaria		0,1 mg/ml
Atipamezol	Orion Pharma, Finlandia		W postaci chlorowodorku atipamezolu, 5 mg/ml
10% kompleks powidon-jod	Mundipharma, Austria
Cement dentystyczny	Heraeus Kulzer, Niemcy	tel. 6603 7633
Fizjologiczny roztwór soli fizjologicznej	Fresenius Kabi, Austria		0,9% NaCl
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma-Aldrich, Niemcy	Zobacz materiał P3813
Izofluoran	AbbVie, Austria
Nawilżające krople do oczu	Thea Pharma, Austria
70% EtOH	Merck, Niemcy	1070172511	Bezwzględny etanol rozcieńczono w ddH2O w celu przygotowania 70% v/v
2,5% Enrofloksacyna	Bayer, Niemcy		Profilaktyczne antybiotyki
Karprofen	Pfizer, Stany Zjednoczone		Leki przeciwbólowe, 50 mg/ml
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)	Sigma-Aldrich, Niemcy	Zobacz materiał P9416
Pentobarbital	Richter Pharma, Austria		Pentobarbital sodowy, 400 mg/ml
Interferon gamma	PeproTech, Stany Zjednoczone	400-20
Czynnik martwicy nowotworu alfa	R&D Systems, Stany Zjednoczone	510-RT-050/CF
Czujnik rMOG1-125	produkt własny w Centrum Medycyny Molekularnej, Instytut Karolinska, Szwecja		Rekombinowana glikoproteina oligodendrocytów mieliny szczura, aminokwasy 1-125 z N-końca, dostępne również w handlu: AnaSpec, AS-55152-500, USA
Niekompletny adiuwant Freunda	Sigma-Aldrich, Niemcy	Zobacz materiał F5506
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich, Niemcy	A9576
Roztwór substratu peroksydazy	Vector Laboratories, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał SK-45000
Ramka stereotaktyczna	David Kopf Instruments, Stany Zjednoczone
Cewniki odpowiednie do rezonansu magnetycznego	PlasticsOne, Stany Zjednoczone	8IC315GPKXXC powiedział:
Atrapy kaniul	PlasticsOne, Stany Zjednoczone	8IC315DCNSPC
z tworzywa sztucznego, odpowiednie do rezonansu magnetycznego	PlasticsOne, Stany Zjednoczone	8L080X093N01
Kaniula łącznika	PlasticsOne, Stany Zjednoczone	8IC313CXSPCC
Śrubokręt z końcówką o średnicy 2 mm
Wiertarka z elastycznym przedłużeniem wału	Proxxon, Niemcy	NR 28 472, NR 28 706, NR 28 620,
Wiertło okrągłe 0,5 mm	Hager & Meisinger, Niemcy	REF310 104 001 001 009
Wiertło, skręcone, 1,3 mm	Hager & Meisinger, Niemcy	REF350 104 417 364 013
skalpel	Braun, Niemcy	BB510
Rękojeść skalpela	Fine Science Tools, Niemcy	Zobacz materiał 91003-12
Aplikator z bawełnianą końcówką	Henry Schein Medical, Austria	Numer katalogowy: 900-3155
Nożyczki chirurgiczne	Fine Science Tools, Niemcy	14101-14, 14088-10
Kleszcze chirurgiczne	Fine Science Tools, Niemcy	11002-12, 11251-35
Zaciski Bulldog	Fine Science Tools, Niemcy	Numer katalogowy 18050-35
Koc homeotermiczny	TSE systems, Niemcy
Lampa na podczerwień	Beurer, Niemcy	616,51
Światło do utwardzania zębów	Guilin Woodpecker Medical, Chiny
Szew wchłanialny	Johnson & Johnson, Belgia	V792E
Programowalna pompa strzykawkowa	World Precision Instruments, Stany Zjednoczone	AL-1000
Rękawice egzaminacyjne
Fartuch chirurgiczny
Golarka elektryczna	Aesculap, Niemcy	Zobacz materiał GT420
Waporyzator do stosowania w lotnym środku znieczulającym	Rothacher Medical, Szwajcaria	CV 30-301-D
Źródło tlenu dla lotnego waporyzatora znieczulającego	Air Liquide, Austria	19 113
Lotna komora anestezjologiczna	Rothacher Medical, Szwajcaria	Zobacz materiał PS-0347
Maska anestezjologiczna dla szczurów	Rothacher Medical, Szwajcaria	PS-0307-A
Strzykawka 1 ml	Codan, Dania	KOD PRODUKTU 62.1612
Igła do wstrzykiwań 26 Gauge	Braun, Niemcy	4657683
Igła o rozmiarze 20 do wstrzykiwania cytokin i immunizacji	Braun, Niemcy	4657519
Szklane strzykawki z końcówką Luer lock	Poulten & Graf, Niemcy	7.140-37
3-drogowy kran	Becton Dickinson, Szwecja	Numer katalogowy: 394600
Inkubator w temperaturze 37°C	Kendro, Niemcy	50042301
Mikropipety	Gilson, Stany Zjednoczone	F167350