Opisano niezawodne i użyteczne podejście do wykrywania modyfikacji histonów w konkretnych genach roślin. Metoda ta łączy immunoprecypitację chromatyny (ChIP) z ilościową PCR w czasie rzeczywistym. Pozwala ona na wykrycie modyfikacji histonów w konkretnych genach odgrywających rolę w różnych procesach fizjologicznych.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie modyfikacji histonów w liściach roślin
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Struktura chromatyny ma kluczowe znaczenie dla regulacji ekspresji genów u eukariotów. W procesie tym istotną rolę odgrywają przebudowa chromatyny, metylacja DNA oraz kowalencyjne modyfikacje aminowych końców N histonów H3 i H41-2. Modyfikacje histonów H3 i H4 obejmują metylację lizyny i argininy, acetylację lizyny oraz fosforylację reszt seryny1-2. Modyfikacje te wiążą się z aktywacją genu, jego represją lub stanem przygotowania genu, który umożliwia szybszą i silniejszą aktywację ekspresji po odebraniu odpowiednich sygnałów (np. wzorców molekularnych związanych z drobnoustrojami, światła, hormonów)3-7.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę niezawodnego i czułego wykrywania specyficznych modyfikacji chromatyny w wybranych genach roślin. Technika ta opiera się na sieciowaniu (zmodyfikowanych) histonów i DNA przy użyciu formaldehydu8,9, ekstrakcji i sonikacji chromatyny, immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla danej modyfikacji9,10, odsieciowaniu kompleksów histon-DNA oraz genowo-specyficznej ilościowej PCR w czasie rzeczywistym. Podejście to okazało się użyteczne w wykrywaniu specyficznych modyfikacji histonów związanych z fotosyntezą C4 u kukurydzy5,11 oraz z odpornością systemową u Arabidopsis3.
Protokół
1. Sieciowanie materiału roślinnego
- Zebrać 1-2g liści Arabidopsis (średnica rozety od 6 do 10cm) do plastikowej probówki o pojemności 50ml i dopełnić do 40mL buforem sieciującym.
- Upewnić się, że liście pozostają zanurzone, np. poprzez umieszczenie dopasowanej gąbki filtracyjnej bezpośrednio nad powierzchnią buforu. Następnie umieścić probówki w eksyكاتهrze.
- Przeprowadzić infiltrację próżniową przez 10min. Do każdej probówki dodać 2,5mL 2M glicyny w celu zatrzymania sieciowania, a następnie odwrócić probówki, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie glicyny.
- Ponownie przeprowadzić infiltrację próżniową przez kolejne 5min, a następnie odlać ciecz, zbierając liście na sicie.
- Przemyć liście dwukrotnie 1L wody w zlewce szklanej, a następnie dokładnie osuszyć liście ręcznikami papierowymi.
- Zebrać liście do nowej plastikowej probówki i zamrozić w ciekłym azocie. Przechowywać liście w temperaturze -80° C do czasu izolacji chromatyny.
2. Izolacja chromatyny
- Liście ucierano w moździerzu z tłuczkiem, które do momentu użycia przechowywano w ciekłym azocie.
- Przenieść proszek do plastikowej probówki o pojemności 50 mL i zawiesić w 30 mL buforu ekstrakcyjnego nr 1.
- Inkubować przez 15 min w temperaturze 4°C na wytrząsarce nadstawkowej.
- Przefiltrować zawiesinę przez cztery warstwy tkaniny miracloth do nowej plastikowej probówki o pojemności 50 mL.
- Wirować przez 20 min przy 2 800 x g w temperaturze 4°C.
- Usunąć nadsącz i zawiesić osad za pomocą pędzla w 1 mL buforu ekstrakcyjnego nr 2. Najpierw dodać niewielką objętość buforu nr 2, następnie zawiesić osad pędzlem, a potem dodać resztę buforu.
- Przenieść zawiesinę do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i wirować przez 10 min przy 12 000 x g w temperaturze 4°C.
- W międzyczasie przygotować probówki do mikrowirówki o pojemności 2 mL zawierające 1,5 mL buforu ekstrakcyjnego nr 3.
- Usunąć nadsącz z wirowanej probówki (krok 2.7) i zawiesić osad w 300 μL buforu ekstrakcyjnego nr 3. Najpierw dodać niewielką objętość buforu nr 3, zawiesić osad pędzlem, a następnie dodać pozostałą część buforu.
- Ostrożnie nanieść pipetą zawiesinę osadu (krok 2.9) na powierzchnię 1,5 mL buforu ekstrakcyjnego nr 3 przygotowanego w kroku 2.8. Należy upewnić się, że dwie fazy nie zmieszają się. Wirować przez 1 h przy 16 000 x g w temperaturze 4°C.
- Usunąć nadsącz i zawiesić osad chromatyny za pomocą pędzla w 300 μL buforu do sonikacji.
- Sonikować chromatynę za pomocą sonotrody lub w kąpieli ultradźwiękowej do uzyskania wielkości DNA wynoszącej około 400 bp. Podczas sonikacji należy dopilnować, aby chromatyna nie nagrzała się powyżej około 30 °C, aby chronić wrażliwe na ciepło wiązania krzyżowe. Czas trwania sonikacji musi zostać ustalony eksperymentalnie, ponieważ różni się on znacznie w zależności od urządzenia. Jako wskazówkę podano ustawienia dla dwóch różnych urządzeń:
W celu sonikacji przy użyciu sonotrody marki Bandelin, poddaj chromatynę w probówce mikrotubkowej 0,6mL pięciokrotnie 20 impulsom przy ustawieniach mocy 25% oraz cyklu = 50. W trakcie tego procesu chłodź próbkę w łaźni lodowej po każdym 20tym impulsie.
W przypadku sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej Diagenode Bioruptor, należy napełnić kąpiel wodą i lodem, a następnie sonikować próbki w probówkach mikrocentryfużowych o pojemności 1.5mL dziesięciokrotnie przez 30 sekund przy ustawieniu „high”. Po każdych 30 sekundach należy chłodzić próbki przez kolejne 30 sekund.
- Wiruj sonikowaną próbkę przez 5min przy 16,000g w temperaturze 4°C, aby wytrącić nierozpuszczony materiał. Nadnadłoś mogą bezpośrednio wykorzystać do immunoprecypitacji. Alternatywnie próbki można zamrozić szokowo w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80°C do czasu dalszego użycia.
3. Immunoprecypitacja
- Przygotować probówki do wirówki o objętości 2 mL zawierające 40μL agarozy z białkiem A oraz 1,8mL buforu do wiązania przeciwciał. Dodać 200μL preparatu chromatyny (krok 2.13).
- Inkubować probówki przez 1h na wytrząsarce orbitalnej.
- Odseparować kuleczki agarozy z białkiem A i wykorzystać nadsącz do immunoprecypitacji.
- Pobrać alikwot 40μL w celu oznaczenia stężenia chromatyny („input”).
- Do 400μL sonikowanej zawiesiny chromatyny dodać 30μL agarozy z białkiem A oraz ilość przeciwciała specyficznego dla modyfikacji wskazaną w poniższej tabeli odczynników i sprzętu.
- Inkubować przez 2,5h lub przez noc na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 4°C.
- Odwirować kuleczki przez 2min przy 440 x g.
- Przemyć osad z kuleczek za pomocą 900μL każdego z buforów do przemywania (patrz lista poniżej). Dla każdego buforu inkubować kuleczki w buforze przez 10min na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 4°C, następnie wirować przez 2min przy 440 x g, odlać nadsącz i dodać kolejny bufor.
- Bufor do przemywania o niskim zasoleniu
- Bufor do przemywania o wysokim zasoleniu
- Bufor do przemywania LiCl
- Bufor do przemywania TE
- Po ostatnim przemywaniu całkowicie usunąć pozostały bufor.
4. Odwiązanie wiązań krzyżowych histonów i DNA oraz oczyszczanie wytrąconego DNA
- Do osadu agarozy oraz do 40μl próbki „input” z kroku 3.4 dodać 100μL buforu do odkrzyżowania, mieszać przez 5min na wstrząsarce wortex, odwirować próbki i inkubować w temperaturze 65°C przez noc.
- Oczyścić DNA za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania DNA lub PCR.
- Zazwyczaj 5μl rozcieńczenia 1:5 końcowego eluatu z kolumny jest wystarczające do przeprowadzenia standardowej ilościowej analizy RT-PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) specyficznej dla konkretnego locus.
5. Tabela buforów
| Bufor do sieciowania | |
| Maślan sodu | 10mM |
| Sacharoza | 400mM |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 10mM |
| β-merkaptoetanol | 5mM |
| Formaldehyd | 3% (v/v) |
| Bufor do ekstrakcji nr 1 | |
| Maślan sodu | 10mM |
| Sacharoza | 400mM |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 10mM |
| β-merkaptoetanol | 5mM |
| Kompletny inhibitor proteaz | 1x |
| Bufor do ekstrakcji nr 2 | |
| Maślan sodu | 10 mM |
| Sacharoza | 250 mM |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 10 mM |
| β-merkaptoetanol | 5 mM |
| MgCl22 | 10 mM |
| Triton X-100 | 1% (m/v) |
| Kompletny inhibitor proteaz | 1x |
| Bufor do ekstrakcji nr 3 | |
| Maślan sodu | 10 mM |
| Sacharoza | 1,7 M |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 10 mM |
| β-merkaptoetanol | 5 mM |
| MgCl22 | 2 mM |
| Triton X-100 | 0,15% (m/v) |
| Kompletny inhibitor proteaz | 1x |
| Bufor do sonikacji | |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 25 mM |
| EDTA-NaOH, pH 8,0 | 5 mM |
| Karta charakterystyki bezpieczeństwa | 0,5% (m/v) |
| Kompletny inhibitor proteaz | 1x |
| Bufor do wiązania przeciwciał | |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 50mM |
| EDTA-NaOH, pH 8.0 | 1mM |
| NaCl | 150mM |
| Triton X-100 | 0.1% (w/v) |
| Bufor płuczący o niskim stężeniu soli | |
| NaCl | 150mM |
| SDS | 0.1% (w/v) |
| Triton X-100 | 1% (w/v) |
| EDTA-NaOH, pH 8.0 | 2mM |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 20mM |
| Bufor do płukania o wysokim stężeniu soli | |
| NaCl | 500mM |
| SDS | 0.1% (w/v) |
| Triton X-100 | 1% (w/v) |
| EDTA-NaOH, pH 8.0 | 2mM |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 20mM |
| Bufor do płukania LiCl | |
| Chlorek litu | 250mM |
| Nonidet-P40 | 1% (v/v) |
| Deoksycholan sodu | 1% (w/v) |
| EDTA-NaOH, pH 8.0 | 1mM |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 20mM |
| Bufor płuczący TE | |
| EDTA-NaOH, pH 8.0 | 10mM |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 1mM |
| Bufor do usuwania wiązań krzyżowych | |
| Tris-HCl, pH 6,8 | 62,5 mM |
| NaCl | 200mM |
| Karta charakterystyki bezpieczeństwa (SDS) | 2% (m/v) |
| DTT | 10 mM |
6. Reprezentatywne wyniki:
Ekspresja genu obronnego Arabidopsis thaliana PR2, kodującego β-1,3-glukanazę o działaniu przeciwdrobnoustrojowym12, została indukowana przez benzotiazodiazol (BTH), syntetyczny analog hormonu roślinnego kwasu salicylowego3. Rysunek 1 wykazuje, że aktywacja ekspresji PR2 wiąże się ze zwiększeniem acetylacji reszt lizyny w histonach H3 i H4 w obrębie promotora PR2. Ponieważ gęstość nukleosomów maleje podczas aktywacji genu13, wartości acetylacji histonów znormalizowano względem sygnału uzyskanego przy użyciu przeciwciała przeciwko niezmiennemu regionowi histonu 3.
Rysunek 1 BTH indukuje acetylację histonów w promotorze PR2 u Arabidopsis. Rośliny traktowano 100μM BTH lub kontrolą w postaci proszku zmywalnego. Po 72h zebrano liście i wyizolowano chromatynę. Sygnał uzyskany po precypitacji z przeciwciałami specyficznymi dla acetylacji (zgodnie z oznaczeniem na rysunku) znormalizowano względem sygnału uzyskanego po precypitacji z przeciwciałem przeciwko niezmiennym domenom histonu H3. Ilość precypitowanej chromatyny oznaczono metodą RT-qPCR. Dane zostały zestandaryzowane względem poziomów modyfikacji histonów w przypadku braku traktowania BTH.
Dyskusja
Kluczowymi etapami protokołu są sieciowanie DNA i histonów, rodzaj i ilość materiału liściowego, rozcieranie materiału oraz sonikacja chromatyny. Bardziej szczegółową dyskusję na ten temat można znaleźć w ref. 9 i 10.
Sonikacja i sieciowanie:
Ważne jest, aby podczas sonikacji rozbić chromatynę na fragmenty o długości około 400bp. Zbyt intensywna sonikacja doprowadzi do zniszczenia chromatyny poprzez degradację DNA i histonów, natomiast niewystarczająca sonikacja pozostawi długie fragmenty chromatyny. Wpływa to na swoistość metody, ponieważ modyfikacje histonów oddalonych od badanego locus nie mogą zostać odróżnione od modyfikacji lokalnych. Wydajność sonikacji najlepiej sprawdzić, pobierając 20μL chromatyny z próbek przed i po sonikacji, odwracając wiązania krzyżowe DNA i histonów, izolując DNA i określając długość pociętego DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Przed elektroforezą do próbek należy dodać RNAzę, ponieważ na tym etapie oczyszczania preparat chromatyny wciąż zawiera duże ilości RNA, które mogą utrudniać wizualizację pofragmentowanego DNA. Próbki nadają się do immunoprecypitacji chromatyny, jeśli DNA z niesonikowanej chromatyny jest dłuższe niż 10kbp, natomiast DNA z sonikowanej chromatyny tworzy rozmycie (smear) z maksymalną intensywnością sygnału wokół 400bp DNA.
Do sieciowania chromatyny w nienaruszonych liściach rutynowo stosujemy 3% (v/v) formaldehyd, jednak w większości przypadków wystarczające może być stężenie 1% (v/v). W naszych doświadczeniach niskie stężenia formaldehydu pozwalają na skrócenie czasu sonikacji oraz zmniejszenie sygnałów tła w następujących po niej reakcjach PCR. Jednak zbyt mała ilość formaldehydu często skutkuje niską powtarzalnością sygnału PCR pomiędzy niezależnymi eksperymentami. Może to wynikać z niewystarczającej penetracji liści przez formaldehyd przy niskich stężeniach. Należy pamiętać o częstej wymianie roztworu stokowego formaldehydu, ponieważ związek ten ma tendencję do polimeryzacji wraz z upływem czasu. Roztwory formaldehydu są stabilne jedynie przez około jeden miesiąc, a okres ten jest w niewielkim stopniu wydłużany przez stabilizację metanolem. Przy ustalaniu warunków eksperymentalnych zaleca się przetestowanie różnych stężeń formaldehydu.
Ilość materiału roślinnego i mielenie:
Ważne jest, aby infiltrować niewielkie ilości materiału liściowego w dużej objętości buforu, aby zapobiec sklejaniu się liści. Sklejanie się liści często prowadzi do niewystarczającej infiltracji formaldehydu. Ponadto zbyt duża ilość materiału roślinnego może zablokować pory tkaniny Miracloth. Efektywność mielenia w znacznym stopniu zależy od zastosowania moździerza z dopasowanym tłuczkiem. Rutynowo mielimy materiał za pomocą schłodzonego ciekłym azotem tłuczka i moździerza, bez dodawania dodatkowego ciekłego azotu, trzykrotnie przez 50 sekund, aż materiał zostanie zmielony na drobny proszek.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) oraz Inicjatywę Doskonałości rządu federalnego i rządów krajowych Niemiec.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agaroza z białkiem A | Roche Group | 11 134 515 001 | zależnie od klasy przeciwciał |
| Agaroza z białkiem G | Roche Group | 11 243 233 001 | zależnie od klasy przeciwciał |
| Przeciwciało anty-hyperacetyl-H4 | EMD Millipore | 06-946 | użyto 5μL |
| Przeciwciało anty-acetyl-H4K5 | EMD Millipore | 07-327 | użyto 5μL |
| Przeciwciało anty-acetyl-H4K8 | EMD Millipore | 07-328 | użyto 5μL |
| Przeciwciało anty-acetyl-H4K12 | EMD Millipore | 07-595 | użyto 5μL |
| Przeciwciało anty-acetyl-H4K16 | EMD Millipore | 07-329 | użyto 5μL |
| Przeciwciało anty-acetyl-H4K18 | EMD Millipore | 07-354 | użyto 1μL |
| Przeciwciało anty-acetyl-H3K9 | EMD Millipore | 07-352 | użyto 5μL |
| Przeciwciało anty-acetyl-H3K14 | EMD Millipore | 07-353 | użyto 1μL |
| Przeciwciało anty-trimethyl-H3K4 | Diagenode | pAB-003-50 | użyto 5μL |
| Przeciwciało anty-dimethyl-H3K4 | EMD Millipore | 07-030 | użyto 5μL |
| Przeciwciało anty-monomethyl-H3K4 | Abcam | ab8895 | 2,5 - 10μL |
| Przeciwciało anty-H3 | Abcam | ab1791 | użyto 1μL do sprawdzenia gęstości histonów |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 TO | |
| Sonotroda MS72 | Bandelin | ||
| Miracloth | Calbiochem | 475855 | |
| Kompletny inhibitor proteaz | Roche Group | 11836145001 |
Bibliografia
- Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO rep. 3, 224-229 (2002).
- Ruthenburg, A. J. Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic. 25, 15-30 (2007).
- Jaskiewicz, M. Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response. EMBO rep. 12, 50-55 (2011).
- Ng, D. W. Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter. Plant Cell. 18, 119-132 (2006).
- Offermann, S. Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize. Plant Physiol. 141, 1078-1088 (2006).
- Deng, W. Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis. Plant Physiol. 143, 1660-1668 (2007).
- Benhamed, M. Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression. Plant Cell. 18, 2893-2903 (2006).
- Bowler, C. Chromatin techniques for plant cells. Plant Journal. 39, 776-789 (2004).
- Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends Biochem. Sci. 25, 99-104 (2000).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Meth. 3, 11-11 (2007).
- Danker, T. Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize. Plant J. 53, 465-474 (2008).
- Uknes, S. Acquired resistance in Arabidopsis. Plant Cell. 4, 645-656 (1992).
- Workman, J. L. Nucleosome displacement in transcription. Genes Develop. 20, 2009-2017 (2006).
Przedruki i uprawnienia
