Trójwymiarowy model kohodowli naciekających limfocytów T w sferoidach nowotworowych

Streszczenie

Źródło: Lin, Y., et al. Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności komórek T w hodowli 3D. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film demonstruje metodę tworzenia trójwymiarowej kohodowli sferoidów guza i limfocytów T. Przygotowuje się odlew agarozowy z mikrostudzienkami zawierającymi sferoidy guza, a następnie dodaje się limfocyty T. Po inkubacji układ ten pozwala na badanie interakcji limfocytów T ze sferoidami guza w kontrolowanym trójwymiarowym środowisku.

Protokół

1. Generowanie sferoid

1. Przygotować i autoklawować 2% agarozy w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (np. 1 g agarozy w 50 ml 1x PBS) i autoklawować 35- i 81-mikrodołkowe formy gumowe.
   ostrożność: Unikaj używania niskotopliwej agarozy do wytwarzania odlewów agarozy do przetwarzania immunohistochemicznego (IHC).
2. Przygotuj odlewy z agarozy
   UWAGA: Odlewy 35-mikrodołkowe są używane do testów inwazji, immunofluorescencji (IF) i izolacji komórek. Odlewy 81-mikrodołkowe są stosowane do testów cytotoksyczności, IHC, izolacji komórek i ekstrakcji kwasów rybonukleinowych (RNA).
   1. Po autoklawowaniu agarozy pozwól stopionej agarozie ostygnąć do około 60–70 °C. W kapturze do hodowli komórkowej należy zastosować technikę aseptyczną i odpipetować 500 μl stopionej agarozy do 81-mikrodołkowej gumowej formy na dołek lub 330 μl do gumowej formy 35-dołkowej na studzienkę.
      ostrożność: Należy unikać tworzenia pęcherzyków podczas mieszania lub pipetowania agarozy. Usunąć wszelkie pęcherzyki, delikatnie pipetując.
   2. Po zestaleniu się agarozy ostrożnie zegnij gumową formę, aby usunąć z niej odlew agarozy. W ten sposób umieść ręce nad odpowiednią płytką studzienki i pozwól, aby odlew agarozy wpadł prosto do jednego dołka płytki studzienki.
      nuta: Zegnij gumową formę w różnych pozycjach, aby uniknąć nadmiernego zginania. Pomocne może być zginanie gumowej formy i delikatne pchanie od dołu w tym samym czasie.
   3. Aby zrównoważyć odlewy agarozy, dodać pożywkę do hodowli komórkowych, składającą się ze zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (2,5 ml / dołek dla płytki 12-dołkowej i 1 ml / dołek dla płytki 24-dołkowej). Umieścić płytkę studzienkową w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂ ) i inkubować przez 1 godzinę.
3. W międzyczasie przygotuj kulturę komórkową do wysiewu.
   nuta: Całkowita liczba wysiewów komórek na odlew agarozy jest ustalana przez badacza. W przypadku mysich linii komórkowych pierwotnego raka trzustki 35 000 komórek/odlew 35 mikrodołków i 81 000 komórek/odlew 81 mikrodołków (średnio 1000 komórek/sferoidy) są wysiewane do wszystkich kolejnych testów. Średnia średnica sferoidy wynosi około 150\u2012200 μm po 48 godzinach.
4. Najpierw usunąć pożywkę do hodowli komórkowych otaczającą odlew agarozy za pomocą pipety P1000, przechylając płytkę dołka. Następnie ostrożnie wyjmij podłoże z komory wysiewu.
5. Ostrożnie wysiewać przygotowaną zawiesinę komórek nowotworowych kroplami do komory wysiewu komórek. Ostrożnie włożyć płytkę dołka z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂) na 15 minut
   nuta: Na tym etapie komórki osiądą w mikrostudzienkach odlewu agarozy.
6. Dodać dodatkowe podłoże na zewnątrz odlewu agarozowego (2,5 ml/dołek dla płytki 12-dołkowej i 1 ml/dołek dla płytki 24-dołkowej).
7. Umieścić płytkę studzienkową z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂) przez 48 godzin
   nuta: Zwykle potrzeba do kilku godzin, aby komórki utworzyły sferoidy w mikrostudzienkach. Ogólnie rzecz biorąc, sferoidy z litych komórek nowotworowych powstają po 24 godzinach i są stabilne po 48 godzinach. Może się to jednak różnić w zależności od różnych linii komórkowych. W razie potrzeby należy zmienić pożywkę do hodowli komórkowych, ostrożnie przechylając płytkę dołka z odlewami agarozy i usuwając otaczającą pożywkę do hodowli komórkowych za pomocą pipety P1000. Następnie ostrożnie dodaj świeżą pożywkę, pipetując ją wzdłuż ścianki studzienki. Zazwyczaj nie jest konieczna zmiana mediów w odlewach ze względu na ich małą objętość i ryzyko usunięcia sferoid.

2. Współhodowla z limfocytami T

1. Ponownie zawiesić wymaganą liczbę limfocytów T w 75 μl (odlew 35 mikrodołków) lub w 190 μl (odlew 81 mikrodołków) odpowiedniej pożywki do hodowli komórek T (RPMI uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą i 100 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny).
2. Najpierw usunąć pożywkę do hodowli komórkowych otaczającą agarozę odlaną pipetą P1000, przechylając płytkę studzienki. Następnie powoli i ostrożnie usuń pożywkę z odlewu, delikatnie celując w jeden róg komory wysiewającej pipetą P200, jednocześnie trzymając płytkę studzienki przechyloną drugą ręką.
3. (Krytyczny krok 1) Ponieważ istnieje ryzyko usunięcia sferoid, należy kontrolować utratę sferoid, porównując liczbę sferoid w mikrostudzienkach przed i po usunięciu pożywki, oglądając pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu.
4. Ostrożnie wysiewać zawiesinę limfocytów T kroplami do komory wysiewającej odlewu agarozy, trzymając pipetę P200 około 0,5 cm nad odlewem.
5. (Krytyczny krok 2) Istnieje ryzyko wypłukania sferoid podczas dodawania limfocytów T. Dlatego bardzo ważne jest, aby dodawać limfocyty T bardzo powoli i około 0,5 cm powyżej komory wysiewu.
   nuta: Jedną z możliwości zmniejszenia liczby wypłukiwanych sferoid jest skierowanie pipety na jeden róg komory wysiewu podczas dodawania limfocytów T, co stwarza ryzyko wypłukania tylko sferoid w tym rogu.
6. Ostrożnie umieścić płytkę dołka z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂ ) na 15 minut.
7. Wyjąć płytkę studzienkową z inkubatora i dodać świeżą pożywkę do hodowli komórkowych (pożywkę Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą i 100 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny) wokół odlanej agarozy, powoli pipetując ją wzdłuż ścianki studzienki.
8. Włożyć studzienkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na 48 godzin.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalki Petriego 3D	Mikrotkanki Inc	Z764019 & Z764051	w protokołach określane jako "formy gumowe"; formy 81-Microwell i 35-Microwell
Szkiełka komorowe 8-dołkowe	Lab-Tek	154534
Agaroza typu I, niska EEO	Sigma-Aldrich	A6013
DMEM, płodowa surowica bydlęca	Rybak termiczny	11965092, 16000044	określane w protokołach jako "pożywka do hodowli komórkowych"
Prędkość obrotowa	Rybak termiczny	11875093	do pożywki do hodowli limfocytów T

(wersja angielska)