Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Zbieranie świeżych granulek kału
- Przygotuj sterylne ręczniki papierowe, kleszcze z końcami i stożkowe probówki o pojemności 50 ml.
- Umieść kilka ręczników papierowych i kleszczyków w oddzielnych torebkach autoklawowych i sterylizuj je w autoklawie w temperaturze 180 °C w suchym ogniu przez 30 minut. Używaj również sterylnych probówek stożkowych. Zważ stożkowe rurki i zapisz ich wagę na probówkach.
- Włącz szafę bezpieczeństwa biologicznego w pomieszczeniu dla zwierząt.
- Weź autoklawowaną, czystą klatkę na myszy bez pościeli i umieść ją w szafce bezpieczeństwa biologicznego. Zdejmij pokrywę i stojak na żywność i umieść je w szafce.
- Umieść sterylne ręczniki papierowe na dnie klatki i umieść metalowy stojak z powrotem na klatce.
- Zidentyfikuj dawców kału w tym samym wieku i umieść klatkę dla myszy w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Otwórz klatkę i delikatnie chwyć mysz-dawcę (C57BL/6J) za ogon i umieść ją na metalowym stojaku na czystej klatce.
- Umieść pokrywę klatki na stojaku i poczekaj, aż zwierzę (zwierzęta) się wypróżni.
UWAGA: Umieść jednocześnie kilka rodzeństwa myszy na stojaku.
- Zbierz granulki kału i umieść je w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zbierz granulki według płci. Nie mieszaj granulek kału zebranych od samców i samic.
- Ponownie zważ probówkę i oblicz wagę granulek kału.
2. Przygotowanie zawiesiny kałowej
- Przygotuj sterylny roztwór (10% glicerol w soli fizjologicznej).
- Dodaj 10 ml 10% glicerolu/soli fizjologicznej do stożkowej probówki na każdy gram granulek kału.
UWAGA: W razie potrzeby zwiększyć objętość roztworu do 20 ml. W tym badaniu użyto również 1 ml roztworu na każdą osadkę (5-10 mg).
- Homogenizować mieszaninę na niskich obrotach za pomocą homogenizatora stołowego lub blendera umieszczonego w okapie wyciągowym w celu ponownego zawieszenia kału (3 x 30 s).
- Przefiltruj zawiesinę kałową przez 2 warstwy sterylnej gazy bawełnianej (10,2 cm x 10,2 cm). Filtrat należy przechowywać tymczasowo w lodówce do 6 godzin lub zapakować do sterylnych fiolek kriogenicznych i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
- Dokładnie wyczyść homogenizator lub blender zgodnie ze standardową procedurą.
3. Podawanie zawiesiny kałowej przez zgłębnik doustny
- Rozmrozić zamrożoną zawiesinę kału na lodzie, jeśli używa się zamrożonych próbek. Wymieszaj rozmrożoną zawiesinę kałową przez wirowanie.
- Przenieść świeżą lub rozmrożoną zawiesinę kału do strzykawek o pojemności 1 ml.
UWAGA: Każda mysz otrzyma łącznie 200 μl zawiesiny kałowej, a każda mysz IL-10-/- w grupie kontrolnej otrzyma 200 μl 10% glicerolu/soli fizjologicznej.
- Zważ myszy i wybierz odpowiedni rozmiar igły do zgłębnika oraz maksymalną objętość dawki.
UWAGA: W przypadku myszy o masie ciała między 20-25 gramami należy użyć zakrzywionej igły do zgłębnika o wadze 20 g i długości 3,81 cm z kulką o średnicy 2,25 mm. Sprawdź gavageneedle.com, aby uzyskać więcej informacji.
- Przetestuj igłębnik do zgłębnika, mierząc długość od czubka nosa myszy do wyrostka mieczykowatego (spód mostka). Napełnić strzykawkę 10% glicerolem/solą fizjologiczną lub zawiesiną kałową i usunąć pęcherzyki powietrza z wnętrza strzykawki i igły.
UWAGA: Jeśli igła jest dłuższa niż długość, umieść znak na trzonie/rurce igły na poziomie nosa. Nie należy przekładać igły/rurki przez zwierzę poza ten punkt, aby zapobiec perforacji żołądka.
- Umieść jedną klatkę na myszy w szafie bezpieczeństwa biologicznego, zdejmij plastikową pokrywę klatki i pozostaw metalowy stojak na miejscu.
- Chwyć jedną mysz za ogon i połóż ją na metalowym stojaku. Jedną ręką trzymaj mysz za ogon, a drugą ręką kciukiem i środkowymi palcami drugiej ręki przytrzymuj zwierzę, chwytając skórę za ramiona. W ten sposób przednie łapy są rozciągnięte na boki, co zapobiegnie wypychaniu igły przez przednie stopy. Delikatnie wyciągnij głowę zwierzęcia do tyłu i przytrzymaj głowę jedną ręką.
UWAGA: Ćwicz obsługę myszy, aż eksperymentator będzie miał pełne zaufanie przed przystąpieniem do eksperymentu.
- Umieść igłębkę na języku w jamie ustnej. Delikatnie przesuwaj się wzdłuż górnego podniebienia, aż igła dotrze do przełyku. Przesunąć igłę płynnie jednym ruchem. Nie należy wciskać igły na siłę, jeśli wyczuwalny jest jakikolwiek opór. Wyjmij igłę i spróbuj ponownie.
- Po prawidłowym umieszczeniu i sprawdzeniu igły, powoli podawać materiał, wciskając strzykawkę przymocowaną do igły. Nie obracać igły ani nie popychać igły do przodu, ponieważ może to spowodować pęknięcie przełyku. Po podaniu należy delikatnie wyciągnąć igłę.
- Umieść mysz z powrotem w klatce domowej. Monitoruj zwierzę przez 5-10 minut, szukając oznak trudności w oddychaniu lub niepokoju. Ponownie monitoruj myszy między 12-24 godzinami po FMT.
