Test in vitro w celu oceny aktywności przeciwnowotworowej komórek CAR T specyficznych dla nowotworu

Streszczenie

Źródło: Kueberuwa, G., et al. A Syngeniczny model chłoniaka z komórek B myszy do przedklinicznej oceny limfocytów T CD19 CAR. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje test in vitro w celu sprawdzenia aktywności limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR). Komórki chłoniaka z komórek B eksprymujące antygen CD19 i lucyferazy cytoplazmatycznej są hodowane wspólnie z komórkami CAR T specyficznymi dla CD19. Wiązanie CAR z CD19 na guzie indukuje limfocyty CAR T do uwalniania cytokin i toksyn, które powodują cytotoksyczność komórek nowotworowych. Aktywność limfocytów CAR T ocenia się poprzez ilościowe określenie uwolnionej cytokiny i zmniejszenie bioluminescencji za pośrednictwem lucyferazy w komórkach nowotworowych.

Protokół

1. Walidacja in vitro aktywności limfocytów CAR T

1. Nasiona syngenicznych docelowych komórek nowotworowych CD19 + z ekspresją lucyferazy lub bez niej o gęstości 1 x^{10 4} komórek w 100 μl kompletnej pożywki z limfocytów T (TCM) / dołku w 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej z dnem U.
2. Dodać 1 x 10⁴ limfocyty T CAR CD19 / studzienkę w objętości 100 μl / studzienkę, aby uzyskać stosunek efektora do celu (E:T) 1:1,
   nuta: Współczynniki E:T należy ustalić dla każdego konstruktu CAR i docelowej linii komórkowej.
3. Stosować same limfocyty T i same komórki nowotworowe jako kontrole ujemne oraz limfocyty T stymulowane octanem forbolu (PMA) (50 ng / ml) i jonomycyną (1 μg / ml) jako kontrolę pozytywną dla uwalniania interferonu gamma (IFNγ). Komórki do kohodowli w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 16–24 h.
4. Po kohodowli odwirować płytki o masie 500 x g przez 5 minut i zebrać supernatant do dalszej analizy ELISA IFNγ i IL-12p70.
   nuta: Można go przechowywać w temperaturze -80 °C.
5. Ponownie zawiesić granulki komórkowe w 100 μl PBS zawierającego lucyferynę (końcowe stężenie 1,5 mg/ml). Inkubować płytki przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Następnie zmierz luminescencję z każdej studzienki za pomocą odpowiedniego luminometru.
   nuta: Czasy ekspozycji muszą być zoptymalizowane pod kątem linii komórkowych i gęstości. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na rysunku 1a. Cytotoksyczność ex vivo limfocytów CAR T może być modyfikowana w celu ekspresji lucyferyny przez wspólną hodowlę z liniami komórkowymi eksprymującymi docelowy antygen. Gdy limfocyty CAR T zabijają komórki docelowe, uwalniana jest lucyferyna, dlatego zmniejszenie sygnału luminometrycznego jest skorelowane z zabiciem komórki. Komórki nietransdukowane mogą często mieć wpływ na żywotność komórek docelowych, szczególnie w długich okresach inkubacji. Zmierz stężenie mysich IFNγ i IL-12p70 w supernatancie zgodnie z protokołami ELISA producenta. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na rysunkach (rys. 1b i 1c). Aktywację ex-vivo limfocytów CAR T przez kohodowlę z liniami komórkowymi wykazującymi ekspresję antygenu docelowego można oznaczyć, analizując zawartość supernatantu za pomocą testu ELISA. Stosunek komórek CAR T do komórek docelowych i długość okresu kohodowli muszą być zoptymalizowane dla każdego konstruktu CAR, docelowej linii komórkowej i analitu. Leczenie PMA i jonomycyną może być stosowane jako kontrola pozytywna w celu potwierdzenia jakości limfocytów T i ich zdolności do reagowania.

Wyniki

Rysunek 1. Walidacja aktywności limfocytów T CAR. Limfocyty T CAR αmCD19 hodowano wspólnie z komórkami chłoniaka A20 zmodyfikowanymi do ekspresji lucyferazy (1 x 10⁴: 1 x 10⁴) przez 16 godzin na 96-dołkowej płytce z dnem U. Po kohodowli komórki granulowano i pobierano supernatant. A) Komórki ponownie zawieszono w PBS, a do oceny żywotności komórek docelowych za...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100X penicylina-streptomycyna-glutamina (PSG)	Gibco (firma Gibco)	10378016
Cytometr przepływowy - LSR Fortessa x20	BD Nauki biologiczne	Numer katalogowy: 658222R1
Surowica bydlęca	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 10270
IL-12 p70 Mysz bez powłoki Zestaw ELISA	Invitrogen	88-7121-76
Sól wapniowa jonomycyny	Sigma- Aldrich	I0634
Luminometr - Lumistart Omega	BMG Labtech	tel. 415-301
Mysi zestaw ELISA IFN-γ	Diaklon	Numer katalogowy: 861.050.010
12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA)	Sigma- Aldrich	Zobacz materiał P8139
RPMI 1640 Średni	Lonza	BE12-167F
XenoLight D-Lucyferyna	Perkin Elmer	122799

płodu powiedział: powiedział: