1. Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
- Hodowla ludzkich fibroblastów w DMEM uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w płytkach 6-dołkowych.
- Przed przystąpieniem do przeprogramowywania fibroblastów należy pokryć 6-dołkowe preparaty Matrigel i inkubować przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej. Przy 80% konfluencji usuń pożywkę z kultur fibroblastów i przemyj raz 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
- Dodać wystarczającą ilość 0,25% trypsyny-EDTA, aby pokryć całą płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
- Gdy komórki zostaną usunięte z dołków, dodaj dwa razy więcej DMEM z 10% FBS niż trypsyny, aby wygasić trawienie trypsyny. Delikatnie pipetuj zawiesinę komórek w górę i w dół, aby rozbić komórki. Policz liczbę pojedynczych komórek za pomocą hemocytometru.
- Przenieść 7 x 105 komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować zawiesinę komórek o sile 200 x g przez 5 minut.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad ogniwa w roztworze do elektroporacji. Elektroporować fibroblasty zgodnie z instrukcjami producenta. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu do elektroporacji i dodać 1 μg każdego wektora episomalnego. Ogniwa elektroporacyjne o nastawach 1 650 V, 10 ms i 3 impulsach czasowych.
- Przenieś zawiesinę komórek do zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% FBS i płytką 5 x 104 komórki na dołek płytki 6-dołkowej. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Po 48 godzinach usunąć pożywkę z transfekowanych kultur fibroblastów i zastąpić pożywką mTeSR. Pożywkę hodowlaną należy wymieniać codziennie, aż indukowane kolonie pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) będą gotowe do wyizolowania. Kolonie iPSC można zaobserwować po 28-35 dniach.
- Gdy będzie gotowy do izolacji, mechanicznie przeciąć kolonię iPSC i ponownie zasiać w pożywce mTeSR z 10 μM inhibitorem kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK) (Y-27632) na 6-dołkowej płytce pokrytej Matrigelem. Codziennie wymieniaj pożywkę hodowlaną.
2. Indukcja neuronalna i utrzymanie ludzkich NPC
- Gdy zbieżność kultur iPSC wynosi około 20%, usuń pożywkę mTeSR i zastąp ją pożywką do indukcji neuronalnej. Uzupełniaj podłoże co drugi dzień.
- Po 7 dniach usuń pożywkę do indukcji neuronów i zastąp ją pożywką konserwacyjną NPC. Uzupełniaj pożywkę co drugi dzień do 7 dni przed pasażowaniem kultur.
- Przed kulturami pasażowymi pokryć płytki/kolby Matrigelem w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę.
- Usuń pożywkę z konflujących się ludzkich kultur NPC i umyj raz 1x PBS, a następnie odessaj PBS.
- Dodać tyle roztworu do oddzielania komórek, aby pokryć wszystkie studzienki, a następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
- Upewnij się, że wszystkie komórki zostały odłączone. Dodać do studzienek/kolb dwukrotnie więcej DMEM/F-12 (Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco/mieszanina składników odżywczych F-12) niż roztworu do oddzielania komórek.
- Przenieść komórki zawierające DMEM/F-12 do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 200 x g przez 5 minut.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml ludzkiej pożywki do konserwacji NPC. Delikatnie pipetuj zawiesinę komórek w górę i w dół, aby rozbić komórki.
- Umieścić jedną trzecią wszystkich komórek w studzienkach/kolbach hodowlanych pokrytych Matrigelem i uzupełnić wystarczającą ilość pożywki uzupełnionej 10 μM Y-27632. Inkubować naczynia hodowlane w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 .
- Dziel kultury 1:3 co 3 do 4 dni i uzupełniaj podłoże co drugi dzień. Utrzymuj ludzkie kultury NPC w dużym zagęszczeniu, aby zapobiec różnicowaniu.
3. Różnicowanie ludzkich NPC na neurony w kokulturach
- Dodaj wektor lentiwirusowy Synapsin1-tdTomato do ludzkiej kultury NPC przed zainicjowaniem różnicowania w neurony. Przygotuj kohodowle astrocytów i neuronów korowych z jednodniowym wyprzedzeniem przed różnicowaniem ludzkich NPC.
- Umyć ludzkie kultury NPC raz 1x PBS i dodać tyle roztworu do oddzielania komórek, aby pokryć wszystkie studzienki/kolby, a następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
- Upewnij się, że wszystkie komórki zostały odłączone. Dodać do studzienek/kolb dwukrotnie większą ilość DMEM/F-12 niż roztworu do oddzielania komórek. Przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki różnicującej neurony. Delikatnie pipetuj zawiesinę komórek w górę i w dół, aby rozbić osad komórek na pojedyncze komórki. Policz liczbę pojedynczych komórek za pomocą hemocytometru.
- Ostrożnie odessać pożywkę z kultur neuronów astrocytów/kory mózgowej. Płytka ludzkich NPC w 5 x 103 komórki/cm2 w 500 μl pożywki różnicującej neurony, uzupełniona 10 μM Y-27632 dla każdego 24-dołka. Delikatnie dodaj pożywkę zawierającą ludzkich NPC do każdej studzienki, aby uniknąć zakłócenia astrocytów i neuronów korowych.
- Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zastępuj połowę pożywki świeżą pożywką co dwa do trzech dni przez co najmniej 28 dni.