Uzyskano zgody etyczne podczas przeprowadzania eksperymentów.
1. Izolacja ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC)
- Upewnij się, że wszyscy dawcy podpisali świadomą zgodę przed pobraniem krwi zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
- Pobrać 30 ml krwi od zdrowych dawców przez przeszkolony personel medyczny zgodnie ze standardowym protokołem.
- Wyizolować PBMNC za pomocą ośrodków o gradiencie gęstości. Użyć 10 ml pożywki z 25 ml krwi w proporcji 1:1 rozcieńczonej solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i odwirować przy 300 x g przez 30 minut.
- Wyizolować warstwę interfazową między plazmą a ośrodkiem o gradiencie gęstości za pomocą pipetowania. Umyć wyizolowane komórki 5 ml sterylnego PBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut. Powtórzyć dwukrotnie.
- Policz liczbę komórek standardowymi metodami przy użyciu komory zliczającej.
2. Aktywacja ludzkiej glikoproteiny zakotwiczonej w glikozylofosfatydyloinozytolu (GPI) poprzez sieciowanie przeciwciał na powierzchni PBMNC
- Umieścić 6 x 106 komórek jednojądrzastych (MNC) w probówkach o pojemności 15 ml i przeprowadzić sieciowanie przeciwciał poprzez inkubację komórek z ludzkim przeciwciałem specyficznym dla białka błonowego połączonego z GPI (30 μg/ml) przez 30 minut w PBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w temperaturze 37 °C.
- Zastąp pożywkę inkubacyjną zmodyfikowaną pożywką Dulbecco firmy Iscove uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
- Hoduj komórki w probówkach polistyrenowych o pojemności 15 ml, umieść probówki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 8-10 dni (bez wstrząsania). W dniu 5 (D5) dodaj dodatkowe 1-2 ml pożywki Iscove uzupełnionej 10% FBS do każdej probówki o pojemności 15 ml.
3. Sortowanie nowo wygenerowanych komórek odróżnicowanych
- Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek (18 μl zawiesiny komórek + 2 μl barwnika fluorescencyjnego) lub w komorze zliczającej.
- Odwirować zawiesinę komórek hodowlanych (5-7 x 106) przy 300 x g przez 10 minut i odessać otrzymany supernatant sterylną pipetą Pasteura.
- Ponownie zawiesić osad komórkowy w 90 μl wstępnie schłodzonego PBS o pH 7,2, 0,5% BSA i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
- Dodać dodatnie nanokulki magnetyczne CD45 (80 μl) do zawiesiny komórek i inkubować na lodzie przez 15 minut.
- Przemyć komórki, dodając 2 ml buforu PBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut.
- Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu PBS.
- Przemyć kolumnę 500 μl wstępnie schłodzonego buforu PBS i umieścić go w polu magnetycznym.
- Umieścić zawiesinę komórek na kolumnie i przemyć ją 500 μl buforu PBS (dwa razy) i przepływem wirówki zawierającym komórki CD45 ujemne. Zbierz je w pożywce Iscove uzupełnionej 1% BSA.
- Policz komórki w komorze liczącej.
4. Przygotowanie naczyń do hodowli komórkowych w celu różnicowania neuronalnego nowo wygenerowanych komórek macierzystych
- Pokryj naczynia hodowlane poli-L-ornityną i lamininą w celu wyhodowania komórek neuronalnych.
- Umieścić szkiełka nakrywkowe w płytkach 4-dołkowych i pokryć je rozcieńczonym w stosunku 1:5 poli-L-ornityną (0,1 mg/ml w wodzie podwójnie destylowanej [ddH2O]) w ddH2O. Umieścić szkiełka nakrywkowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę. Następnie umyć z ddH2O.
- Powoli rozmrażaj lamininę (0,5-2,0 mg/ml) i dodaj do wierzchu szkiełek nakrywkowych. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
- Przygotować pożywkę do indukcji neuronalnej N2 składającą się z 49 ml zmodyfikowanej mieszaniny Eagle i składników odżywczych F-12 (D-MEM/F12) firmy Dulbecco, 500 μl suplementu N2, 400 μl aminokwasów endogennych (NEAA), roztworu zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) o stężeniu końcowym 20 ng/ml (przygotowanej ze 100 μg/ml roztworu podstawowego) i heparyny o stężeniu końcowym 2 ng/ml.
- Usunąć nadmiar lamininy przez pipetowanie i dodać pożywkę neuronalną N2 do szalek hodowlanych.
5. Hodowla neuronalnych komórek krwi odróżnicowanej
- Hodowla komórek CD45 ujemnych pochodzących z BD na szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą/ornityną przez 2 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w pożywce N2 w celu zainicjowania różnicowania neuronalnego nowo wytworzonych komórek BD.
- Hodowla komórek dalej w pożywce różnicowania neuronów składającej się z 48 ml pożywki neurobazalnej, 500 μl L-glutaminy, 1 ml suplementu B27, 500 μl NEAA, 50 μl rekombinowanego ludzkiego czynnika neurotroficznego pochodzenia glejowego (GDNF) w stężeniu 5 μg/250 μl w PBS/0,1% BSA i 50 μl rekombinowanego czynnika neurotroficznego pochodzącego z ludzkiego mózgu (BDNF) w ssu 5 μg/200 μl w PBS/0,1% BSA i 50 μl roztworu kwasu askorbinowego 2,9 g/50 ml w PBS. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
