Ustanowienie wspólnej hodowli komórek miazgi zębowej i neuronów trójdzielnych do komunikacji krzyżowej

Streszczenie

Źródło: Barkley, C. et al., Metoda wspólnej hodowli do badania wzrostu neurytów w odpowiedzi na sygnały parakrynne miazgi zębowej.J. Vis. Exp. (2020).

Ten film prezentuje technikę tworzenia wspólnej kultury neuronów trójdzielnych i pierwotnych komórek miazgi zębowej za pomocą filtra transwell. W tym fizycznie oddzielonym stanie komórki mezenchymalne uzyskane z tkanki miazgi zęba wydzielają parakrynne cząsteczki sygnałowe, które przechodzą przez pory, promując różnicowanie i migrację neuronów w kierunku komórek mezenchymalnych, tworząc system kohodowli.

Protokół

1. Przygotowanie talerza

UWAGA: Upewnij się, że pokrywa płytki jest założona podczas wszystkich etapów inkubacji i płukania poza sterylnym kapturem do hodowli tkanek, aby zapobiec zanieczyszczeniu podczas przetwarzania próbki.

1. Filtry powłokowe
   1. Rozcieńczyć lamininę do 10 μg/ml. Przefiltruj rozcieńczoną lamininę pod maską.
   2. Odpipetować 450-500 μl 10 μg/ml lamininy do każdego dołka na 24-dołkowej płytce.
   3. Umieścić filtr transwell o porowatości 3 μm w studzience tak, aby stykał się z roztworem lamininy i pozostawić go w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 2 godziny lub na noc. Pory filtra powinny umożliwiać dyfuzję części roztworu i pokrycie zarówno górnej, jak i dolnej części filtra. Filtry te należy zużyć w ciągu 48 godzin lub przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.

2. Poszycie komórek

1. Myszy: Genetyczne zmiany komórek miazgi zębowej (DP) można przeprowadzić (ale nie jest to wymagane) w celu zbadania interakcji mezenchymalno-neuronalnych.
2. Rozwarstwienie, dyspersja i poszycie DP (rysunek 1)
   UWAGA: Do rozwarstwienia DP należy użyć bardzo cienkich kleszczy o prostych krawędziach. Ultracienkie krawędzie pozwolą użytkownikowi zaklinować krawędź kleszczy między zmineralizowaną strukturą a tkanką DP.
   1. Zbierz myszy P5-P8. Na tym etapie zęby powinny się mineralizować, a korzeń jest otwarty.
   2. Znieczulenie noworodków przez hipotermię poprzez umieszczenie ich w naczyniu w lodówce o temperaturze 4 °C do momentu, aż przestaną się ruszać lub reagować na dotyk. Eutanazja noworodków przez ścięcie głowy i zgodnie z procedurami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC) w wyznaczonej placówce.
   3. Przygotuj 3-5 ml podwielokrotności 0,25% kwasu trypsynowo-etylenodiaminowego (trypsyna-EDTA) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, aby zebrać DP z każdej myszy. Ułatwi to trawienie miazgi zębowej myszy po urodzeniu. Użyj więcej niż 3 ml w przypadku trawienia tkanek od więcej niż 10 myszy po urodzeniu.
   4. Umieść głowę na jednorazowym podkładzie tak, aby usta były skierowane w stronę sufitu, a podstawa szyi leżała płasko na powierzchni roboczej. Użyj żyletki w ruchu piłowania, aby oddzielić żuchwę od szczęki.
   5. Opcjonalnie usuń język nożyczkami lub kleszkami, aby umożliwić łatwiejszy dostęp do zębów trzonowych.
   6. Umieść otwartą głowę w naczyniu na sterylnym gaziku i umieść próbkę pod mikroskopem preparacyjnym (ryc. 1D).
   7. Usuń tkankę kostną wyrostka zębodołowego otaczającą pierwsze zęby trzonowe. Zęby podżuchwowe nie są w tym momencie w pełni wyrżnięte. Włóż kleszcze do otworu pęcherzykowego i odsuń tkankę od zęba w kierunku policzkowej (policzkowej) lub językowej (języka) strony jamy ustnej. Zęby szczęki będą wymagały całkowitego usunięcia szczeliny wokół zęba w celu odsłonięcia i usunięcia.
   8. Delikatnie przenieś pierwsze zęby trzonowe podżuchwowe i szczękowe (M1) do oddzielnego naczynia do hodowli komórkowych z 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
   9. Powtarzaj 2.2.4-2.2.8, aż wszystkie M1 zostaną zebrane. Podczas zbioru należy przechowywać naczynie zawierające M1 na lodzie.
   10. Usuń zewnętrzny narząd szkliwa (EOE) otaczający zewnętrzną stronę każdego M1. Alternatywnie można to zrobić po kroku 2.2.11.
   11. Za pomocą zestawu kleszczy obróć M1 tak, aby guzki były opuszczone, a otwarty korzeń odsłonięty. Na spodzie zęba pojawi się owalny otwór i nieprzezroczysta tkanka DP otoczona cienką warstwą zębiny i szkliwa.
   12. Za pomocą końcówki kleszczy delikatnie poluzuj DP, przesuwając jednym ramieniem kleszczy po wewnętrznym obwodzie zmineralizowanej tkanki. Usuń tkankę DP ze zmineralizowanej struktury i przenieś ją do trzeciej płytki zawierającej 1x PBS. Wyjmij EOE, jeśli nie został jeszcze oddzielony (Rysunek 1E).
   13. Przenieś całą tkankę DP do 0,25% trypsyny-EDTA w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zmieszać mieszaninę i umieścić w ciepłej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10 minut. Można to zrobić za pomocą tych samych kleszczy lub długich kleszczyków do fiolek. Tkanka będzie trudna do rozproszenia i będzie wymagała wirowania co 3-4 minuty. NIE przekraczaj 10 minut trypsynizacji, ponieważ trypsyna może uszkodzić błony komórkowe.
   14. Pod sterylnym kapturem dodać podgrzane pożywki do współhodowli (Tabela 1) do końcowego stosunku co najmniej 1:1 pożywki do trypsyny w celu inaktywacji enzymu. Większe proporcje są dopuszczalne, jeśli pożądana jest większa dyspersja tkanek.
   15. Kilkakrotnie pipetować pożywkę w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml, aby jeszcze bardziej rozproszyć DP w podłożu. Uważaj, aby uniknąć dużych pęcherzyków. Całkowita dyspersja jest prawie niemożliwa ze względu na lepki charakter tkanki. Jednak nie jest to również konieczne, ponieważ komórki będą migrować na zewnątrz z tkanki po pokryciu.
   16. Przenieś 1 ml zdyspergowanego DP do każdej studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej (ryc. 1F).
   17. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i pozwolić komórkom na przyczepienie się i migrację z nierozproszonej tkanki przez 48 godzin przed zmianą podłoża. Komórki pierwotne muszą być posiane w stosunkowo wysokich stężeniach, aby osiągnąć 85-90% konfluencji w ciągu 1 tygodnia. Jeśli nie zostanie to osiągnięte po 1 tygodniu, wyrzuć płytkę.
3. Rozwarstwienie, dyspersja i poszycie neuronów trójdzielnych
   UWAGA: W tym protokole obrazowanie wzrostu neurytów w kokulturze z komórkami DP zostało zoptymalizowane przy użyciu młodzieńczej (6-tygodniowej) witaminy B6. Myszy Cg-TG(Thy1-YFP)16Jrs/J. Ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy myszy Thy1-YFP ma żółty znacznik białka fluorescencyjnego (YFP), którego ekspresja zaczyna się około P6-P10 w neuronach i wzrasta wykładniczo w całym układzie nerwowym w okresie poporodowym i dorosłym. YFP i GFP mają konserwatywne sekwencje, które pozwalają na zabarwienie tych nerwów przeciwciałami anty-GFP, co powoduje zabarwienie panneuronalne. Ostatecznie myszy te pozwalają na lepszą wizualizację i kwantyfikację neuronów używanych i hodowanych w hodowli komórkowej.       
   1. Poddaj eutanazji dorastające myszy dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięciu szyjki macicy.
   2. Odetnij głowy myszom i usuń skórę z czaszki. Pamiętaj, aby podać równoważną liczbę mężczyzn i kobiet.
   3. Włóż końcówkę nożyczek do mikropreparowania w podstawę czaszki. Przeciąć wzdłuż szwu strzałkowego czaszki (ryc. 1A).
   4. Wykonaj cztery małe poziome nacięcia: dwa wzdłuż szwów koronalnych przy uszach i dwa wzdłuż szwów lambdoidalnych u podstawy czaszki. Powinno to utworzyć dwa płaty kości.
   5. Użyj kleszczy, aby odkleić dwie płaty kości. To powinno ujawnić mózg.
   6. Usuń mózg. Przenieś głowę do naczynia do hodowli tkankowej z 1x PBS i umieść pod mikroskopem.
   7. Zlokalizuj zwoje nerwu trójdzielnego (TG), które są łatwo widoczne u gryzoni¹³, znajdujące się w oponie twardej między mózgiem a kością wyrostka szczękowego (ryc. 1B).
   8. Odetnij trzy gałęzie, które biegną do oczu, szczęki i żuchwy i przenieś zwoje do zimnego 1x PBS za pomocą cienkich kleszczy o prostych krawędziach. Podczas zbioru naczynie zawierające zwoje TG należy przechowywać na lodzie.
   9. Po zebraniu wszystkich wiązek TG przenieść zwoje jaj do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 5 mg/ml sterylnie przefiltrowanej kolagenazy typu II za pomocą kleszczyków do fiolek.
   10. Zmieszać kolagenazę z wiązką TG i umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 25-30 minut. W tym czasie wyjmij stożkową rurkę z łaźni wodnej, wiruj i wracaj do kąpieli co 5-10 minut.
   11. Odwirować roztwór neuronu kolagenazy-TG przez 2 minuty przy 643 x g.
   12. Pod kapturem do hodowli tkankowej delikatnie odessać kolagenazę za pomocą mikropipety.
   13. Dodać 5 ml 1% sterylnie przefiltrowanej trypsyny typu II i odwirować. Umieść rurkę stożkową w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 5 minut.
   14. Odwirować mieszaninę trypsyny-TG przez 5 minut przy 643 x g. Usuń górną część trypsyny za pomocą mikropipety, tak aby neurony TG nie zostały usunięte. W probówce nadal będzie płyn.
   15. Dodaj tyle pożywki, aby dezaktywować pozostałą trypsynę (w stosunku 1:1 lub niższym trypsyny do pożywki).
   16. Policz liczbę komórek i rozcieńcz roztwór do 200 000 komórek/ml (250 μl komórki zawierającej 50 000 komórek).
   17. Umieść powlekane filtry transwell z sekcji 1.2 w studzienkach z DP.
   18. Rozcieńczyć roztwór zawierający komórki, tak aby było 200 000 komórek/ml. Odpipetować 250 μl na filtr transwell i hodować komórki w temperaturze 37 °C przez noc (rysunek 1F).
   19. Następnego dnia zastąp pożywkę 1 ml pożywki do kohodowli z 1 μM urydyną i 15 μM 5'-fluoro-2 deoksyurydyną, aby zatrzymać nadmierną proliferację komórek mezenchymalnych, które mogą zapobiegać wzrostowi neurytów. Opcjonalnie: Dodaj czynniki wzrostu lub inhibitory w tym podłożu w przypadku próby dalszej manipulacji.

Tabela 1: Podłoża współkulturowe.

składnik	głośność	koncentracja
MEM α	440 ml
Inaktywowana na gorąco płodowa surowica bydlęca	50 ml	10%
100x L-glutamina	5 ml	1x
Penicylina-streptomycyna 100 x	5 ml	1x
Zmień pożywkę w dniu 2 na inhibitory mitotyczne w tych końcowych stężeniach
Urydynę		1 μM
5'-Fluor-2'deoksyurydyna		15 μM

Wyniki

Ryc. 1: Schemat sekcji myszy w celu uzyskania komórek do kohodowli.(A) Schemat miejsca, w którym należy przeciąć, aby otworzyć czaszkę myszy i zlokalizować nerwy TG, pokazany na czarno na ostatnim przedstawieniu. Nożyczki wskazują, gdzie włożyć końcówki nożyczek, aby ciąć wzdłuż przerywanych linii. (B) Połączony obraz ciemnego pola i GFP przedstawiający nerwy TG Thy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5-fluoro-2'-deoksyurydyna	Sigma-Aldrich	F0503	Stosowany jako inhibitor mitotyczny w stężeniu 15 μM w pożywkach współhodowlanych, dzień 2
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej	Corning	3524	Płytka do wspólnej hodowli
B6; 129- Tgfbr2tm1Karl/J	Laboratorium Jacksona	Numer katalogowy: 12603	Model myszy Tgfbr2f/f używany do komórek miazgi zęba w zoptymalizowanym protokole
Klasa B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J	Laboratorium Jacksona	Numer katalogowy: 3709	Genotyp mysiego modelu Thy1-YFP stosowany w neuronach trójdzielnych
Kolagenaza typu II	Milipory	234155-100MG	Służy do rozpraszania neuronów trójdzielnych
Surowica bydlęca płodu	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 10437	Dodatek do pożywek współkulturowych
Cienkie kleszcze	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11413-11	Cienkie kleszcze do rozwarstwiania TG
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	Powleka wkładki transwella przy końcowym stężeniu 10 μg/ml, przyjmuje się, że roztwór podstawowy wynosi 1,5 mg/ml
L-glutamina	Gibco (firma Gibco)	25030081	Dodatek do pożywek współkulturowych
Nożyczki do mikropreparacji	Sigma-Aldrich	S3146-1EA	Nożyczki preparacyjne do otwarcia czaszki
Minimalna niezbędna pożywka a	Gibco (firma Gibco)	12571063	Baza podłoży do wspólnej hodowli
Penicylina-Streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	15070063	Dodatek antybiotykowy do pożywek współhodowlanych
Inhibitor fosfatazy	Sigma-Aldrich	Numer telefonu 04 906 837 001	Dodatek do buforu RIPA do ekstrakcji białka z komórek miazgi zęba po kohodowli
Wkładka do hodowli komórkowych ThinCert	Greiner Bio-One	662631	Wkładki Transwell do neuronów trójdzielnych w testach współhodowlanych
Trypsyna-EDTA (0,25%)	Gibco (firma Gibco)	25200056	Używany do dyspersji komórek miazgi zębowej
Trypsyna typu II	Sigma-Aldrich	T-7409	Służy do rozpraszania neuronów trójdzielnych
Ultra cienkie kleszcze	Narzędzia naukowe	Rozdział 11370-40	Ultra cienkie kleszcze do preparacji
Urydynę	Sigma-Aldrich	U3750	Stosowany jako inhibitor mitotyczny w stężeniu 1 μM w pożywkach współhodowlanych, dzień 2
Kleszcze do fiolek	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 110006-15	Długie kleszcze do transferu tkanek na stożki

powiedział: TGL powiedział: powiedział: