Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Nakładanie plastrów na wkładki
- Wypełnić każdą studzienkę 6-dołkowej płytki 1 200 μl pożywki do hodowli warstw. Napełnij wszystkie niewykorzystane studzienki 1 200 μl PBS i wypełnij środkową przestrzeń płytki 5 ml 1x PBS. Przechowywać tę płytkę w temperaturze 37 °C.
- Za pomocą łyżki cedzakowej umieść plasterek mózgu w podłożu na wkładce, delikatnie popychając plasterek, aby był całkowicie zanurzony. Powtórz te czynności dla wszystkich plasterków.
- Użyj p1000, aby wyciągnąć 1 ml pożywki hodowlanej w plastrach z górnej części wkładki i dozować ją na dno dołka. Usuń i wyrzuć nadmiar pożywki, aż krawędzie agarozy wokół wycinka mózgu staną się widoczne. Zrób to dla pozostałych plasterków.
- Podnieś wkładkę za krawędź za pomocą kleszczy, przechyl i usuń nadmiar mediów. Następnie szybko przenieś wkładkę do naczynia o średnicy 35mm2 zawierającego 1 ml pożywki do hodowli w plastrach. Użyj 2 par ostrych kleszczy, aby usunąć agarozę wokół tkanki, uważając, aby nie rozciągnąć/nie uszkodzić, nie przeciąć ani nie zrobić w błonie (najłatwiej, jeśli zrobisz rozdarcie na samej krawędzi agarozy, a następnie rozsuń agarozę z każdej strony). Następnie przenieś wkładkę z powrotem na płytkę 6-dołkową i powtórz dla pozostałych plasterków.
- W kapturze do hodowli tkankowej z wyłączoną dmuchawą (aby zapobiec wysychaniu plastrów) usuń fragmenty agarozy z każdej błony.
- Przenieść plastry na płytkę 6-dołkową przygotowaną w kroku 1.1 i przechowywać płytkę w temperaturze 37 °C. Inkubować plastry przez 24-48 godzin.
2. Zmiana pożywki Slice Culture
- Powtórzyć krok 1.1 ze świeżą płytką 6-dołkową.
- W kapturze do hodowli tkankowych z wyłączoną dmuchawą przenieś wkładki na nowe 6-dołkowe płytki zawierające świeże podłoże do plastrów.
3. Posiewanie komórek nowotworowych na wycinku
- Sonikuj barwnik Cm-DiI i wiruj na średniej prędkości przez 2 minuty.
- Odwiruj komórki nowotworowe używane do nakładki przy 201 x g przez 5 minut. Następnie ponownie zawiesić w 2 ml pożywki do hodowli w plastrach
.
- Dodać 7 μl Cm-DiI do 2 ml komórek i pożywki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
- Wirować komórki w temperaturze 201 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w 200 μl pożywki do krojenia. Delikatnie rozcierać, aby rozdzielić komórki (10-20 razy lub do momentu, gdy osad zniknie), a następnie dodać 800 μl pożywki do krojenia, aby uzyskać całkowitą objętość 1,000 μl.
- Policz żywe komórki nowotworowe za pomocą błękitu trypanowego. Dodaj zielone mikrosfery fluorescencyjne do komórek nowotworowych w tym samym stężeniu co komórki. Te obojętne mikrosfery będą służyć jako kontrola. Odwiruj mieszaninę komórek/mikrosfer w masie 201 x g przez 5 minut i ponownie zawieś w żądanej ilości pożywki do hodowli w plastrach. Płytki o gęstości 6 000 komórek/plaster w objętości 65 μl. Liczba komórek platerowanych na plasterek może być zwiększona w zależności od preferencji i dostępności.
- W kapturze do hodowli tkankowej dozować komórki w 65 μl pożywki/plasterek na środek wycinka.
