Typowanie DNA szczepów Mycobacterium leprae z wykorzystaniem zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR) – analiza długości fragmentów (FLA)

Podsumowanie

Trąd, wywoływany przez Mycobacterium leprae, wciąż występuje endemicznie w wielu miejscach. Aby poznać sposób rozprzestrzeniania się i drogi przenoszenia trądu, istotne jest określenie, który szczep M. leprae zainfekował pacjenta. Typowanie z wykorzystaniem zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR) jest jedną z takich metod.

Streszczenie

Badanie transmisji trądu jest szczególnie trudne, ponieważ czynnik etiologiczny, Mycobacterium leprae, nie może być hodowany w laboratorium. Jedynymi źródłami bakterii są pacjenci z trądem oraz eksperymentalnie zakażone pancerniki i myszy nude. W związku z tym wiele metod stosowanych we współczesnej epidemiologii nie jest dostępnych do badania trądu. Pomimo szeroko zakrojonego globalnego programu leczenia farmakologicznego trądu wdrożonego przez WHO¹, choroba ta pozostaje endemiczna w wielu krajach, z około 250 000 nowych przypadków każdego roku.² Cały genom M. leprae został zmapowany^3,4, a zidentyfikowano wiele loci zawierających powtórzone segmenty o długości 2 lub więcej par zasad (tzw. mikrosatelity i minisatelity).⁵ Szczepy kliniczne M. leprae mogą różnić się liczbą tandemowych segmentów powtórzeń (krótkie powtórzenia tandemowe, STR) w wielu z tych loci.^5,6,7 Analiza zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR)⁵ jest wykorzystywana do rozróżniania różnych szczepów prątków trądu. Niektóre loci wydają się być bardziej stabilne od innych, wykazując mniejszą zmienność w liczbie powtórzeń, podczas gdy inne zmieniają się szybciej, niekiedy u tego samego pacjenta. Choć zmienność niektórych VNTR wzbudziła pytania dotyczące ich przydatności do typowania szczepów^7,8,9, pojawiające się dane sugerują, że analiza wielu loci o różnym stopniu stabilności może służyć jako wartościowe narzędzie epidemiologiczne. Wielolocusowa analiza VNTR (MLVA)¹⁰ była stosowana do badania ewolucji i transmisji trądu w kilku krajach, w tym w Chinach^11,12, Malawi⁸, na Filipinach^10,13 i w Brazylii¹⁴. MLVA składa się z kilku etapów. Najpierw, z biopsji klinicznych lub rozmazów z nacięć skóry (SSS) ekstrahuje się DNA bakteryjne wraz z DNA tkanki gospodarza.¹⁰ Następnie pożądane loci są amplifikowane z wyekstrahowanego DNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). W jednej reakcji stosuje się startery znakowane fluorescencyjnie dla 4-5 różnych loci, a łącznie w czterech reakcjach amplifikuje się 18 loci.¹⁰ Produkty PCR mogą być poddawane elektroforezie w żelu agarozowym w celu weryfikacji obecności pożądanych fragmentów DNA, a następnie przekazywane do fluorescencyjnej analizy długości fragmentów (FLA) z wykorzystaniem elektroforezy kapilarnej. Jako kontrolę pozytywną stosuje się DNA z bakterii pasażowanych przez pancerniki o znanej liczbie kopii powtórzeń dla każdego locus. Chromatogramy FLA są następnie analizowane przy użyciu oprogramowania Peak Scanner, a długość fragmentu jest przeliczana na liczbę kopii VNTR (allela). Na koniec analizowane są wzorce haplotypów VNTR, które w połączeniu z danymi klinicznymi pacjentów mogą służyć do śledzenia dystrybucji typów szczepów.

Protokół

Celem niniejszego artykułu wideo jest przedstawienie przeglądu procesu pracy wraz z formatem i interpretacją danych dla badaczy, którzy mogą dopiero rozpoczynać tego rodzaju prace (Rysunek 1). Zawiera on demonstrację technik, uproszczone protokoły oraz praktyczne wskazówki opisane w wcześniej opublikowanych pracach.^5,10

Ogólny przebieg prac i zaplecze laboratoryjne:

Do tego rodzaju badań powinny być przeznaczone co najmniej 3 oddzielne strefy robocze. Laboratorium powinno posiadać: 1) strefę przed-PCR z dygestorium do PCR (czystą komorą lub izolowanym obszarem roboczym) do przygotowywania starterów (rozcieńczania, przygotowywania alikwotów i mieszania), 2) oddzielną komorę z laminarnym przepływem powietrza do manipulacji i dodawania DNA do mieszanin PCR oraz 3) strefę po-PCR do przygotowywania i nakładania żeli oraz przygotowywania próbek do FLA. Startery i próbki DNA powinny być przechowywane w oddzielnych zamrażarkach i lodówkach. Kontaminacja starterami jest jednym z głównych i najbardziej uciążliwych problemów w tego typu pracach laboratoryjnych. Pipety używane do starterów i mieszanin PCR NIE powinny być używane do DNA. Dla stref przed-PCR, PCR i po-PCR powinny być przeznaczone osobne zestawy pipet. Zazwyczaj jeden badacz może przetworzyć od 12 do 18 próbek w ciągu 12-24 godzin, korzystając ze standardowego wyposażenia laboratoryjnego.

Przed rozpoczęciem każdego etapu prac:

• Należy założyć fartuch laboratoryjny i rękawiczki. Rękawiczki powinny być noszone przez cały czas podczas pracy z próbkami biologicznymi, starterami, DNA i bromkiem etydyny. Rękawiczki należy często zmieniać.
• Pracę należy prowadzić w komorze do PCR, komorze bezpieczeństwa biologicznego lub w czystej strefie roboczej.
• Należy użyć świeżego papieru lub podkładki laboratoryjnej.
• Należy przygotować pojemniki na odpady odpowiednie dla cieczy i końcówek do pipet.
• Wnętrze komory do PCR oraz pipety należy przetrzeć 70% etanolem.
• Przed przygotowaniem reakcji PCR pipety i obszar roboczy należy naświetlać światłem UV przez 15 minut. (Światło ultrafioletowe powoduje sieciowanie zanieczyszczeń DNA na powierzchniach).
• Do materiałów zawierających DNA, startery i odczynniki PCR należy zawsze używać końcówek do pipet z filtrem zapobiegającym tworzeniu się aerozoli.
• Wszelkie probówki/stripy/płytki zawierające ciecz należy odwirować przed otwarciem, aby zapobiec ucieczce aerozolu i kontaminacji krzyżowej podczas manipulacji.

1. M. leprae przygotowanie DNA

Próbki kliniczne zawierające M. leprae pozyskuje się od pacjentów z trądem odwiedzających kliniki dermatologiczne. Rutynowe próbki diagnostyczne mogą obejmować biopsje wycinane skóry, rozmazy ze skóry (tzw. slit skin smears) lub wymazy z nosa. Zazwyczaj biopsje wycinane lub rozmazy ze skóry są najwłaściwsze do badań epidemiologii molekularnej, ponieważ są czyste i zawierają wystarczającą ilość M. leprae. Wykorzystanie tych materiałów do celów badawczych musi zostać zatwierdzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

1. Próbki biopsji lub zeskrobany naskórek należy utrwalić w fiolce z nakrętką zawierającej 1 ml 70% etanolu.
2. Każdą próbkę należy odwirować w laboratoryjnej wirówce z regulowaną prędkością przy 12,000 x g przez 15 minut.
3. Należy usunąć nadosad i przenieść go do probówki do mikrocentryfugi. W razie potrzeby może być przydatne ponowne odwirowanie tych próbek w celu późniejszego odzyskania dodatkowej tkanki lub DNA.
4. Do próbek tkanek należy dodać 500 μl soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i pozostawić na 1 godzinę, aby usunąć resztki etanolu i rehydratować próbkę.
5. Próbki należy odwirować w wirówce laboratoryjnej przy 12,000 x g przez 20 minut. Roztwór PBS należy wylać do pojemnika na odpady częściowo wypełnionego roztworem dezynfekującym.
6. DNA bakterii należy wyekstrahować za pomocą zestawu Qiagen DNEasy Blood and Tissue zgodnie z określonymi wytycznymi.
7. Wyekstrahowane DNA należy podzielić na 4 aliquoty. Dwie porcje należy przechowywać w temperaturze -80°C do przyszłego wykorzystania, jeśli wymagana będzie powtarzalność wyników testów lub gdy dostępne będą nowe technologie. Jedną porcję należy przechowywać w temperaturze -20°C, a jedną w 4°C do szybszego użycia.
8. Zaleca się przygotowanie „ślepej próby ekstrakcji” wraz z próbkami tkanek. Ślepa próba jest poddawana wszystkim opisanym powyżej zabiegom, ale bez użycia tkanki. Należy przeprowadzić reakcję PCR dla ślepej próby ekstrakcji wraz z próbkami pacjentów, aby upewnić się, że technika ekstrakcji operatora jest prawidłowa, a odczynniki są wolne od kontaminacji DNA.

2. Przygotowanie starterów

1. Startery dla loci, dla których dostępne są najobszerniejsze dane dotyczące typów szczepów, wymieniono w Tabeli 1. Dla potrzeby multiplex PCR łączy się cztery lub pięć starterów. Każdy starter dla danego locus posiada na końcu 5' fluorescencyjny znacznik chemiczny, który zostanie wykryty podczas analizy długości fragmentów (FLA) metodą elektroforezy kapilarnej.
2. Dla każdej kombinacji multiplex PCR znakowane startery oraz odpowiadające im startery odwrotne dla każdego locus umieszcza się w osobnych probówkach Eppendorfa: startery bezpośrednie w jednej probówce, a odwrotne w drugiej. Startery zapasowe przygotowuje się jako roztwory o stężeniu 100μM (Rycina 2a), z których część rozcieńcza się 10-krotnie do stężenia 10 μM przy użyciu buforu TE (1x Tris-EDTA, pH 8.0). Pozostałe alikwoty roztworów starterów o stężeniu 100 μM przechowuje się w temperaturze -20°C do późniejszego użycia.
3. Miesza się równe ilości każdego startera o stężeniu 10 μM, co daje końcowe stężenie każdego startera na poziomie 2μM. Po dodaniu kombinacji starterów do mieszaniny PCR (Tabela 3), końcowe stężenie każdego startera spada do 0.2 μM.

Po dodaniu połączonych starterów do mieszanin PCR (Tabela 3), ich stężenia końcowe spadają do 0,2μM dla każdego z nich.

3. Amplifikacja bakteryjnego DNA przy użyciu multiplex PCR

1. Przygotowanie do PCR
   • Odnotuj liczbę próbek, które zostaną użyte, i przygotuj arkusz z wymaganymi odczynnikami oraz ich objętościami przed pobraniem niezbędnych materiałów plastikowych i innych akcesoriów.
   • Oznacz numery próbek na sterylnych probówkach/ paskach/ płytkach przeznaczonych do PCR. Pamiętaj o uwzględnieniu kontroli pozytywnej i negatywnej.
2. Przetrzyj termocykler roztworem czyszczącym (takim jak Decon ELIMINase) i zaprogramuj go zgodnie z Tabelą 2. Zmień rękawiczki po czyszczeniu i przed kontaktem z primerami oraz innymi odczynnikami.
3. Przygotuj Mastermix do PCR zgodnie z Tabelą 3 i oznacz probówki/ paski/ płytkę do PCR kombinacją primerów oraz numerami próbek, które zostaną użyte.
4. Odpipetuj 18μl Mastermixu do każdej oznaczonej probówki lub dołka PCR. Zmień rękawiczki.
5. Przetrzyj osobny dygestorium biologiczne oraz pipety 70% etanolem, aby oczyścić i zdezynfekować obszar roboczy i narzędzia, a następnie naświetlaj obszar roboczy i pipety światłem UV przez 15 minut, aby usieciować wszelkie zanieczyszczenia DNA. Zmień rękawiczki.
6. W czystym dygestorium biologicznym dodaj 2μl matrycy DNA do Mastermixu w każdej probówce/ dołku płytki PCR, aby uzyskać całkowitą objętość 20μl (Rycina 2b). Do wszystkich materiałów ciekłych używaj końcówek do pipet z filtrem zapobiegającym tworzeniu się aerozoli.
7. Krótko odwiruj probówki/ paski/ płytki PCR, aby wymieszać zawartość.
8. Umieść probówki/ paski/ płytkę z próbkami w termocyklerze i uruchom program PCR.
9. Po zakończeniu programu wyjmij produkty z termocyklera i przechowuj w temperaturze 4°C do czasu przeprowadzenia elektroforezy.

4. Elektroforeza żelowa produktów PCR

*Protokół ten jest standardowy od wielu lat i stanowi opcjonalny krok, który można zastosować w przypadku chęci potwierdzenia produktów PCR przed wysłaniem ich do analizy FLA.

1. W oddzielnym obszarze roboczym po PCR przygotuj 2% żel agarozowy. W kolbie użyj 2,0g proszku agarozy na 100ml 1x buforu TBE (Tris/Borat/EDTA). Podgrzewaj mieszaninę w kuchence mikrofalowej przez około 1,5-2 minuty. Zamieszaj zawartość, w razie potrzeby ponownie podgrzewając, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Lekko schłodź i wlej żel do formy, używając grzebienia z odpowiednią liczbą wgłębień dla próbek.
2. Wyjmij produkty PCR z temperatury 4°C i wiruj przez około 30 sekund.
3. Wymieszaj 2-5μl produktu PCR z 0,5-1μl buforu do ładowania żelu 5x lub 6x (bufor do ładowania jest dostępny w ofercie różnych firm lub może być przygotowany w laboratorium; przepisy są dostępne online).
4. Nałóż do wgłębień żelu 6μl mieszaniny próbki z buforem do ładowania. Do jednego z wgłębień dodaj marker wielkości DNA (najlepiej marker 20 bp).
5. Prowadź elektroforezę w żelu przy napięciu 100V przez około 90 minut.
6. Mocz żel w roztworze bromku etydyny przez 15-30 minut, a następnie w ultraczystej wodzie destylowanej przez taki sam czas.
7. Wykonaj obrazowanie żelu przy naświetlaniu światłem UV. Powinien pojawić się prążek dla każdego z 4-5 segmentów DNA w kombinacji (Rycina 3).
8. Utylizuj żel zgodnie z polityką instytucji dotyczącą materiałów niebezpiecznych. Roztwór bromku etydyny można wykorzystać wielokrotnie przed właściwą utylizacją.

5. Przygotowanie próbek do analizy długości fragmentów (FLA)

1. W czystej probówce Eppendorf przygotować mieszaninę główną (master mix) zawierającą 12μl świeżo przygotowanego roztworu formamidu Hi-Di oraz 0,3μl standardu wielkości GeneScan -500 LIZ (oba od Applied BioSystems) na każdą próbkę do analizy. (Formamid Hi-Di chemicznie denaturuje nici DNA przed elektroforezą kapilarną, co eliminuje konieczność podgrzewania). Korzystając z optycznej płytki reakcyjnej z 96 dołkami, odmierzyć 12,3μl mieszaniny formamidu i LIZ do każdego dołka przeznaczonego na próbki, a następnie odstawić płytkę na bok.
2. Sporządzić mapę płytki do dokumentacji, wskazując, która próbka DNA znajduje się w każdym dołku (Rycina 4a).
3. Korzystając z probówek/stripsów lub płytki 96-dołkowej, dodać 1μl produktu PCR (z Części 3) do 59μl wody o jakości PCR, tworząc rozcieńczenie produktu PCR w stosunku 1:60. Stopień rozcieńczenia można dostosować w zależności od natężenia sygnału z danych FLA lub jasności prążków w żelu. Wystarczające mogą być nawet niższe stężenia DNA (1:120 lub 1:180).
4. Dodać 1μl rozcieńczonego produktu PCR do odpowiedniego dołka w płytce zawierającej mieszaninę formamidu i LIZ.
5. Szybkość i wydajność pracy można znacznie zwiększyć, jeśli PCR również wykonano w płytce 96-dołkowej. Można wtedy ustawić sekwencyjnie trzy takie płytki: Płytka 1 z produktami PCR, Płytka 2 z wodą sterylną do rozcieńczenia produktów PCR oraz Płytka 3 z formamidem i drabiną wielkości do analizy długości fragmentów. Pipeta wielokanałowa pozwala na szybkie przygotowanie do analizy FLA.

Analiza próbek za pomocą analizatora genetycznego

6. Zkalibruj analizator genetyczny w celu wykrywania zastosowanych fluoroforów zgodnie z instrukcją producenta. Upewnij się, że użyty zestaw barwników zawiera LIZ.
7. Uzupełnij pojemniki do płukania wodą oraz wlej nowy bufor do elektroforezy (Running Buffer) z EDTA (1x) (Applied BioSystems) do komór buforowych.
8. Załóż naciętą silikonową przegrodę na płytkę, a następnie umieść płytkę w odpowiedniej tacy. Naciśnij przycisk „Tray” w analizatorze genetycznym, aby wysunąć autoprobnik. Umieść tacę na autoprobniku i zamknij drzwiczki analizatora genetycznego.
9. Utwórz lub zaimportuj arkusz kalkulacyjny do analizy. Pliki do importu mają rozszerzenie .plt i są w formacie z rozdzielaczem tabulatorem. Pliki można modyfikować w programie Excel (Microsoft) lub programach podobnych.
10. Próbki są wstrzykiwane do kapilary (długość 50 cm, polimer POP-7) przy zastosowaniu napięcia wstrzykiwania 1,6 kV przez 15 s. Elektroforeza kapilarna odbywa się przy napięciu 15 kV w temperaturze 60°C przez 1800 sekund. Cały proces trwa około 45 minut.
11. Po zakończeniu analizy dane dla każdej badanej próbki są konwertowane na pliki z rozszerzeniem .fsa i zapisywane w folderze plików płytki (Rysunek 4b). Każdy plik danych ma rozmiar około 100 kB i może być przechowywany na dysku flash, skompresowany i przesłany pocztą elektroniczną. Pliki danych można przeglądać za pomocą odpowiedniego oprogramowania, takiego jak GeneMapper lub Peak Scanner firmy ABI.

6. Analiza wyników długości fragmentów

1. Analiza danych z fluorescencyjnej elektroforezy kapilarnej wymaga specjalistycznego oprogramowania. Jeśli takie oprogramowanie nie jest dostępne, należy przejść na stronę internetową Applied BioSystems i pobrać program Peak Scanner. Oprogramowanie jest bezpłatne i działa bardzo sprawnie. https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603624
2. Otwórz program Peak Scanner, wybierz opcję „Start New Project”, a następnie „Add Files”. Wczytaj do programu wybrane pliki danych .fsa, w tym kontrole pozytywną i negatywną.
3. Zaznacz i „analizuj” wszystkie wczytane pliki. Upewnij się, że dla każdej próbki ustawiono „Size Standard: GS500(-250)” oraz „Analysis Method: Sizing Default-pp”. Naciśnij „Analyze”.
4. Zbadaj wielkość w parach zasad każdego kolorowego piku wygenerowanego przez fragmenty DNA w próbkach.
5. Zapisz wartość wielkości każdego piku w parach zasad i porównaj ją z pikiem kontroli pozytywnej.
6. Piki w próbkach kontroli pozytywnej powinny być zgodne z liczbą par zasad i odpowiadającą im liczbą powtórzeń tandemowych wymienioną w Tabelach 4-7.
7. Określ liczbę segmentów krótkich powtórzeń tandemowych obecnych w każdym allelu próbki poprzez porównanie z kontrolą pozytywną. Stosujemy linię NHDP63, dla której zsekwencjonowano liczbę kopii VNTR w każdym badanym locus.⁴
8. Wprowadź zapisane dane do arkusza kalkulacyjnego w celu przeprowadzenia analiz porównawczych i/lub matematycznych. „Odciski palców” VNTR lub haplotypy to ciągi alleli w określonych locus, które są charakterystyczne dla szczepu M. leprae.

7. Reprezentatywne wyniki

Elektroforeza żelowa produktów PCR powinna w ideałach warunkach przynieść prążek dla każdego locus w kombinacji starterów (Rysunek 3). Na Rysunku 3 żel podzielony jest na dwie sekcje: górna sekcja zawiera próbki PCR z kombinacji 1, a dolna sekcja próbki z kombinacji 2. Każda sekcja zawiera drabinę molekularną 20 par zasad, a następnie produkty PCR uzyskane z 8 próbek pacjentów. Kombinacja 1 zawiera również kontrolę negatywną oraz kontrolę pozytywną (szczep NHDP63). (Kontrole dla kombinacji 2 znajdowały się na innym żelu). Należy zauważyć, że większość próbek wyraźnie wykazuje 5 prążków, po jednym dla każdego locus w kombinacji. W niektórych przypadkach prążki mogą znajdować się zbyt blisko siebie, aby pojawić się jako oddzielne loci, co skutkuje widocznością tylko 4 prążków.

Przewidywane wielkości amplikonów wymieniono w Tabeli 1. Nasze laboratorium wykorzystuje szczep NHDP63 M. leprae jako kontrolę pozytywną. Badano dwa rodzaje segmentów powtarzalnych: loci mikrosatelitarne (z powtórzeniami od 1 do 5 zasad) oraz loci minisatelitarne (z segmentami dłuższymi niż 5 par zasad powtórzonymi wielokrotnie). ⁵

Interpretacja plików danych z elektroforezy kapilarnej opiera się na dwóch standardach: wewnętrznym standardzie wielkości fragmentów DNA o nazwie GeneScan -500LIZ (ABI) oraz zewnętrznej dodatniej kontroli w postaci próbki amplifikowanego DNA bakteryjnego.

Chromatogramy FLA, wyświetlone za pomocą oprogramowania Peak Scanner, przedstawiono na Rysunkach 5a, 5b oraz 6.

Peak Scanner dostarcza danych o rozmiarze amplikonu (oś x w parach zasad) i sile sygnału (oś y). (Rysunek 5b) Dostępne są również dodatkowe dane dotyczące pola powierzchni piku itp., choć najważniejsze są wartości rozmiaru i wysokości piku. Piki o wysokości mniejszej niż 100 jednostek są zazwyczaj uznawane za sygnał zbyt słaby, aby był wiarygodny.

Rysunek 6 porównuje kontrolę pozytywną (NHDP63) oraz dwie próbki od pacjentów, wykazując zmienność liczby powtórzeń tandemowych w locus (GTA)9. W kontroli pozytywnej sekwencja (GTA) powtarza się 10 razy. VNTR NHDP63 oraz wielkość amplikonu zostały zweryfikowane za pomocą sekwencjonowania genów. Amplikon PCR pacjenta 4 jest o 3 bp krótszy niż w kontroli pozytywnej, co wskazuje na obecność jedynie 9 jednostek powtórzeń, natomiast pacjent 6 posiada amplikon o 3 bp dłuższy niż NHDP63, co ujawnia 11 powtórzeń (GTA). Pacjent 2 miał niski indeks bakteryjny (BI) z niewielką lub żadną replikacją PCR DNA, w związku z czym nie wystąpił sygnał FLA.

Trudności w interpretacji danych FLA czasami występują w wyniku tzw. „jąkania” (stuttering). Podczas reakcji PCR polimeraza DNA może wytwarzać fragmenty, które są o jeden lub więcej powtórzeń dłuższe lub krótsze od allelu źródłowego. Są one zazwyczaj rozpoznawane jako piki o niższej wysokości otaczające pik główny. Znajdują się one „na drabinie”, co oznacza, że różnią się od piku głównego o poprawną liczbę par zasad segmentu powtórzeniowego. Wynikiem jest rodzina pików o tym samym kolorze. Rysunek 7 przedstawia to zjawisko dla locus (TA)10.

Kolejną trudnością, która czasami pojawia się podczas FLA, jest tzw. „+A” lub „A-tailing” (dołączanie ogona A), w którym polimeraza DNA dodaje pojedynczą zasadę [zazwyczaj adeninę (A)] do końca 3' skopiowanego fragmentu DNA. W FLA objawia się to jako pik po prawej stronie piku głównego lub piku stutter, który jest większy o 1 parę zasad od piku sąsiedniego, co pokazano na Rysunku 8. Nie należy go mylić z pikiem głównym lub pikiem stutter. Pik główny i jego ogon A są uważane za jeden gatunek. Ogon A nie zmienia liczby powtórzeń VNTR. (Niektóre zestawy polimerazy DNA są zaprojektowane tak, aby specyficznie promować A-tailing w celu zredukowania tego efektu zakłócającego. Promowanie pełnego A-tailingu ma tendencję do generowania pojedynczego piku zamiast pary pików).

Ekstrakty DNA oraz produkty PCR zawierają zarówno DNA M. leprae, jak i ludzkie DNA; jednak z wyjątkiem (TA)18, startery są na tyle specyficzne, że amplifikują one wyłącznie DNA bakteryjne, a amplifikacja ludzkiego DNA jest znikoma lub nie występuje. (TA)18 często generuje pik przy 242 parach zasad, który pochodzi z ludzkiego DNA i nie występuje w próbkach DNA pasażowanych w pancernikach (Rysunek 9).

Okres trwałości starterów jest zazwyczaj długi, pod warunkiem że są one przechowywane w temperaturze -20°C, wyjmowane jedynie do bezpośredniego użycia, a następnie przechowywane w 4°C aż do zużycia. Startery powinny zachować stabilność w 4°C przez 1-2 tygodnie. Mimo że przygotowywanie mieszanin starterów do PCR jest dość czasochłonne, zaleca się przygotowywanie jedynie takiej ilości mieszaniny, która zostanie wykorzystana w najbliższym czasie. Mieszaniny starterów wydają się ulegać częściowej degradacji podczas długotrwałego przechowywania.

Bufor TE należy rozdzielić na mniejsze porcje z większych zapasów; alikwoty można przechowywać w zamrożeniu lub w temperaturze pokojowej. Większe alikwoty o objętości 200-400μl są odpowiednie do rozcieńczania suchych lub skoncentrowanych zapasów starterów (Rysunek 2a). Mniejsze alikwoty o objętości 10-50 μl są użyteczne do uzupełniania objętości kombinacji starterów 3 i 4. Bufor TE jest tani, a zużyte alikwoty należy utylizować.

Zestawy enzymów do PCR multipleksowego są dość kosztowne i powinny być przechowywane w zamrożeniu (-20°C) do momentu użycia. Po przygotowaniu do reakcji PCR wszelkie niewykorzystane roztwory multipleksowe należy niezwłocznie przenieść do temperatury 4°C. Mały zestaw Qiagen Multiplex PCR Kit zawiera 3 probówki z mieszanką multipleksową, z których każda zawiera 0,85 ml (850 μl) roztworu; jest to ilość wystarczająca na około 65-70 reakcji PCR.

Zasadniczo należy unikać wielokrotnych, gwałtownych zmian temperatury materiałów stosowanych w tego rodzaju pracach laboratoryjnych, w tym próbek DNA, starterów oraz roztworów z zestawu do multipleksowania. Wszystkie materiały powinny być przechowywane w temperaturze -20°C do momentu użycia, a następnie w temperaturze 4°C aż do ich zużycia. Przechowywanie DNA w perspektywie długoterminowej powinno odbywać się w temperaturze -80°C.

Wszystkie materiały zawierające zużyte tkanki, startery i/lub DNA należy poddać autoklawowaniu i zutylizować, gdy nie będą już przydatne. Wszystkie próbki traktowane bromkiem etydyny lub formamidem należy traktować jako odpady niebezpieczne i utylizować zgodnie z polityką instytucji dotyczącą materiałów niebezpiecznych.

Tabela 1: Wielkości amplikonów dla szczepu NHDP63

Tabela 2: Parametry cykli dla PCR VNTR

Tabela 3: Przygotowanie do PCR

Tabela 4: Wyznaczenie alleli dla kombinacji 1

Tabela 5: Wyznaczone allele dla kombinacji 2

Tabela 6: Odczyty alleli dla kombinacji 3

Tabela 7: Wyznaczone allele dla Kombinacji 4

Rycina 1: Diagram przepływu procesu VNTR-FLA

Rycina 2. (a) Przygotowanie starterów górnych dla Kombinacji 1 (zdjęcie probówki Eppendorf dzięki uprzejmości www.clker.com). (b) Setup PCR (dla 8 reakcji PCR) (zdjęcie probówki Eppendorf dzięki uprzejmości www.clker.com)

Rycina 3. Żel agarozy z produktami PCR DNA dla kombinacji 1 i 2 VNTR

Rysunek 4. (a) Mapa płytki FLA. (b) Pliki danych FLA: *.fsa

Rysunek 5. (a) Chromatogram FLA kontroli pozytywnej (NHDP63) dla loci VNTR kombinacji 1. (b) Peak Scanner dane dotyczące wielkości i liczebności amplikonu (GTA)9

Rycina 6. Porównanie próbek PCR z kontrolą pozytywną (NHDP63) dla locus (GTA)9

Rycina 7. Piki główne i stutter dla (TA)10

Rycina 8: Piki +A (ogon A) sąsiadujące z pikami głównymi lub stutter.

Rycina 9: Główny pik (TA)18, piki stutter i pik ludzkiego DNA

Rycina 10: (A) Różnicowanie szczepów M. leprae na podstawie danych VNTR. (B) Różnicowanie szczepów M. leprae na podstawie odcisku DNA MLVA

Dyskusja

Pobieranie próbek skóry od pacjentów z trądem wymaga udziału wykwalifikowanych klinicystów lub techników pracujących w klinikach dermatologicznych. Pracownicy laboratoryjni zajmujący się tymi próbkami muszą z najwyższą starannością stosować fartuchy laboratoryjne, rękawiczki oraz ochronę oczu, a podczas pracy z zakażonymi próbkami tkanek ludzkich lub tkanek pancernika korzystać z komory bezpiecznej biologicznie. Kluczowe jest również odkażanie powierzchni i narzędzi. Praca w czystej, sterylnej komorze bezpiecznej biologicznie jest istotna dla uniknięcia kontaminacji próbek DNA.

Ekstrakcja DNA stała się stosunkowo łatwa dzięki opracowaniu zestawów do izolacji przez firmy takie jak Qiagen. Należy ściśle przestrzegać instrukcji. Wszystkie próbki powinny być przechowywane w niskiej temperaturze, gdy nie są używane. Należy unikać wielokrotnych, gwałtownych zmian temperatury próbek.

Startery DNA wykorzystane w tej pracy można zamówić w różnych firmach, które zostały wymienione w bibliografii na końcu niniejszej publikacji. Należy zachować szczególną ostrożność i pracować ze starterami w środowisku wolnym od DNA, aby uniknąć kontaminacji. Startery są dostarczane w formie suchego proszku i muszą zostać rozpuszczone w buforze TE i rozcieńczone do stężenia 100μM, a następnie podzielone na mniejsze aلیکwoty (Rysunek 2a). Roztwory robocze starterów są następnie rozcieńczane do stężenia 10μM. Ponownie przypominamy, aby nie używać próbek DNA w obszarach lub dygestoriach, w których przygotowywane i stosowane są startery.

Produkty PCR powinny być również przechowywane w niskiej temperaturze, gdy nie są używane.

Przygotowanie żelu agarozowego o stężeniu 3% zapewnia lepszą separację prążków DNA, lecz wymaga dłuższego czasu elektroforezy. W celach czysto jakościowych zazwyczaj wystarczające jest stężenie 2%. Roztwór bromku etydyny stosowany do barwienia DNA w żelach agarozowych jest silnie aktywną genotoksyną, która wchłania się przez skórę. Należy obchodzić się z tym roztworem oraz z zabarwionymi nim żelami z ogromną ostrożnością, zawsze pamiętając o noszeniu rękawiczek. Po pracy z jakimikolwiek próbkami DNA lub materiałami zawierającymi bromek etydyny należy dokładnie umyć ręce. Roztwór barwiący z bromkiem etydyny, roztwory płuczące oraz żele należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Żele nie są wymagane rutynowo; ten krok można pominąć po ustanowieniu metod FLA. Jest on czasochłonny i zużywa odczynniki.

Roztwór formamidu stosowany do przygotowywania próbek do FLA jest również wysoce toksyczny i należy z nim obchodzić się ostrożnie. Po jego użyciu należy umyć ręce. Utylizację przeprowadzić zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

Odczytywanie wyników FLA przy użyciu oprogramowania Peak Scanner może być trudne. W CSU opracowano podstawowy zestaw oznaczeń alleli (liczba powtórzeń tandemowych) (Tabele 4-7). (Należy zauważyć, że Tabele 4-7 mogą nie być wyczerpujące. W miarę badania innych szczepów M. leprae mogą zostać znalezione allele z liczbą kopii wykraczającą poza wymienione zakresy). Jednym z szczególnych wyzwań są piki typu „stutter” (szum). Są to grupy pików, szczególnie w przypadku STR obejmujących powtórzenia zaledwie 2-3 par zasad, takich jak (TA)10. Czasami wybór właściwego piku do odczytu jest utrudniony (Rysunek 7). Na tym rysunku głównym pikiem w kontroli pozytywnej jest pik przy 190 bp. Piki o mniejszej wysokości, które są o 2, 4 lub nawet 6 par zasad większe lub mniejsze od piku głównego, nazywa się „pikami stutter”. Zamieszanie może również wprowadzić tzw. A-tailing. Zjawisko A-tailingu zostało opisane wcześniej w tekście oraz na Rysunku 8. Wreszcie, jeśli produkty PCR są w próbkach bardzo liczne, piki mogą pojawić się z podwójnym wierzchołkiem. W takim przypadku należy odczytać środek kształtu piku. (Patrz Rysunek 6, Pacjent 6).

Zarządzanie danymi w tego typu badaniach może być niezwykle wymagającym zadaniem. Ważne jest rejestrowanie wszystkich istotnych informacji dla każdego eksperymentu, takich jak: data wykonania zadania lub procedury, operator, mapy pasków/płytek, zamówienia FLA, warunki i składy mieszanin PCR, daty wykonania elektroforezy i wykonania zdjęć, temperatury przechowywania, rozcieńczenia matryc DNA, lokalizacje plików elektronicznych FLA itp. Dobra organizacja i zarządzanie danymi mogą zaoszczędzić wiele godzin poświęconych w przyszłości na poszukiwanie konkretnych informacji.

Opisane tutaj prace laboratoryjne są prowadzone od kilku lat na Colorado State University oraz w innych ośrodkach na całym świecie. Zaczyna wyłaniać się szerszy obraz tego, co oznaczają wszystkie zgromadzone dane i w jaki sposób mogą one być przydatne w przyszłości. Rysunki 10A oraz 10B pokazują, jak te odciski palców DNA mogą być wykorzystane do rozróżnienia różnych szczepów M. leprae pomiędzy krajami (10A) lub nawet pomiędzy rodzinami (10B). Wykazano, że przypadki powiązane rodzinie i społeczności niosą szczepy VNTR M. leprae o podobnych lub identycznych typach. Nadzieją jest, że uda się uzyskać dalszy wgląd w tryb(y) transmisji trądu, co pozwoli na opracowanie systemu wczesnego wykrywania sieci transmisji dla osób najbardziej narażonych oraz rozpoczęcie leczenia farmakologicznego przed wystąpieniem trwałych uszkodzeń neurologicznych i dermatologicznych.