Typowanie DNA szczepów Mycobacterium leprae z wykorzystaniem zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR) – analiza długości fragmentów (FLA)

Podsumowanie

Trąd, wywoływany przez Mycobacterium leprae, wciąż występuje endemicznie w wielu miejscach. Aby poznać sposób rozprzestrzeniania się i drogi przenoszenia trądu, istotne jest określenie, który szczep M. leprae zainfekował pacjenta. Typowanie z wykorzystaniem zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR) jest jedną z takich metod.

Streszczenie

Badanie transmisji trądu jest szczególnie trudne, ponieważ czynnik etiologiczny, Mycobacterium leprae, nie może być hodowany w laboratorium. Jedynymi źródłami bakterii są pacjenci z trądem oraz eksperymentalnie zakażone pancerniki i myszy nude. W związku z tym wiele metod stosowanych we współczesnej epidemiologii nie jest dostępnych do badania trądu. Pomimo szeroko zakrojonego globalnego programu leczenia farmakologicznego trądu wdrożonego przez WHO¹, choroba ta pozostaje endemiczna w wielu krajach, z około 250 000 nowych przypadków każdego roku.² Cały genom M. leprae został zmapowany^3,4, a zidentyfikowano wiele loci zawierających powtórzone segmenty o długości 2 lub więcej par zasad (tzw. mikrosatelity i minisatelity).⁵ Szczepy kliniczne M. leprae mogą różnić się liczbą tandemowych segmentów powtórzeń (krótkie powtórzenia tandemowe, STR) w wielu z tych loci.^5,6,7 Analiza zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR)⁵ jest wykorzystywana do rozróżniania różnych szczepów prątków trądu. Niektóre loci wydają się być bardziej stabilne od innych, wykazując mniejszą zmienność w liczbie powtórzeń, podczas gdy inne zmieniają się szybciej, niekiedy u tego samego pacjenta. Choć zmienność niektórych VNTR wzbudziła pytania dotyczące ich przydatności do typowania szczepów^7,8,9, pojawiające się dane sugerują, że analiza wielu loci o różnym stopniu stabilności może służyć jako wartościowe narzędzie epidemiologiczne. Wielolocusowa analiza VNTR (MLVA)¹⁰ była stosowana do badania ewolucji i transmisji trądu w kilku krajach, w tym w Chinach^11,12, Malawi⁸, na Filipinach^10,13 i w Brazylii¹⁴. MLVA składa się z kilku etapów. Najpierw, z biopsji klinicznych lub rozmazów z nacięć skóry (SSS) ekstrahuje się DNA bakteryjne wraz z DNA tkanki gospodarza.¹⁰ Następnie pożądane loci są amplifikowane z wyekstrahowanego DNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). W jednej reakcji stosuje się startery znakowane fluorescencyjnie dla 4-5 różnych loci, a łącznie w czterech reakcjach amplifikuje się 18 loci.¹⁰ Produkty PCR mogą być poddawane elektroforezie w żelu agarozowym w celu weryfikacji obecności pożądanych fragmentów DNA, a następnie przekazywane do fluorescencyjnej analizy długości fragmentów (FLA) z wykorzystaniem elektroforezy kapilarnej. Jako kontrolę pozytywną stosuje się DNA z bakterii pasażowanych przez pancerniki o znanej liczbie kopii powtórzeń dla każdego locus. Chromatogramy FLA są następnie analizowane przy użyciu oprogramowania Peak Scanner, a długość fragmentu jest przeliczana na liczbę kopii VNTR (allela). Na koniec analizowane są wzorce haplotypów VNTR, które w połączeniu z danymi klinicznymi pacjentów mogą służyć do śledzenia dystrybucji typów szczepów.

Protokół

Celem niniejszego artykułu wideo jest przedstawienie przebiegu pracy wraz z formatem i interpretacją danych dla badaczy, którzy mogą dopiero rozpoczynać tego rodzaju prace (Rysunek 1). Zawiera ono prezentację technik, uproszczone protokoły oraz praktyczne wskazówki opisane w wcześniej opublikowanych pracach.^5,10

Ogólny przebieg prac i zaplecze laboratoryjne:

Do tego rodzaju badań należy wyznaczyć co najmniej 3 oddzielne strefy pracy. Laboratorium powinno posiadać: 1) obszar przed-PCR z komorą do PCR (czysta strefa lub izolowany obszar roboczy) do przygotowywania starterów (rozcieńczania, przygotowywania alikwotów i mieszania), 2) oddzielną komorę z bezpieczną powierzchnią roboczą do manipulacji i dodawania DNA do mieszanin PCR oraz 3) obszar po-PCR do przygotowywania i ładowania żeli oraz przygotowywania próbek do FLA. Startery i próbki DNA powinny być przechowywane w oddzielnych zamrażarkach i lodówkach. Kontaminacja starterami jest jednym z głównych i najbardziej uporczywych problemów w tego typu pracy laboratoryjnej. Pipety używane do starterów i mieszanin PCR NIE powinny być używane do DNA. Dla obszarów przed-PCR, PCR i po-PCR powinny być przeznaczone oddzielne zestawy pipet. Zazwyczaj jeden badacz może przetworzyć 12-18 próbek w ciągu 12-24 godzin, korzystając ze standardowego wyposażenia laboratoryjnego.

Przed rozpoczęciem każdego etapu prac:

• Należy założyć fartuch laboratoryjny i rękawiczki. Rękawiczki powinny być noszone za każdym razem podczas pracy z próbkami biologicznymi, starterami, DNA i bromkiem etydium. Rękawiczki należy często zmieniać.
• Pracuj w komorze do PCR, komorze z laminarnym przepływem powietrza (BSC) lub w czystej strefie roboczej.
• Użyć świeżej podkładki laboratoryjnej lub bloku papieru.
• Przygotuj pojemniki na odpady odpowiednie dla cieczy oraz końcówek do pipet.
• Przetrzyj wnętrze komory PCR oraz pipety 70% etanolem.
• Naświetlaj pipety i obszar roboczy światłem UV przez 15 minut przed przygotowaniem reakcji PCR. (Światło ultrafioletowe powoduje sieciowanie zanieczyszczeń DNA na powierzchniach).
• Do materiałów zawierających DNA, primery oraz odczynniki do PCR należy zawsze używać końcówek do pipet z filtrem zapobiegającym tworzeniu się aerozoli.
• Przed otwarciem należy odwirować wszystkie probówki, paski lub płytki zawierające ciecz, aby zapobiec ucieczce aerozoli i kontaminacji krzyżowej podczas manipulacji.

1. M. leprae przygotowanie DNA

Próbki kliniczne zawierające M. leprae pobiera się od pacjentów z trądem odwiedzających kliniki dermatologiczne. Rutynowe próbki diagnostyczne mogą obejmować wycinki skóry pobrane wykrawaczem, rozcierki ze skóry lub wymazy z nosa. Zazwyczaj wycinki skóry lub rozcierki są najodpowiedniejsze do badań epidemiologii molekularnej, ponieważ są one czyste i zawierają wystarczającą ilość M. leprae. Wykorzystanie tych materiałów do celów badawczych musi zostać zatwierdzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

1. Próbki z biopsji lub wymazy ze skóry (slit skin smear) należy utrwalić w fiolce z zakrętką zawierającej 1 ml 70% etanolu.
2. Każdą próbkę należy odwirować w wirówce stołowej z regulacją prędkości przy 12 0 x g przez 15 minut.
3. Należy usunąć nadfiltr i przelać go do probówki do mikrowirówki. W razie potrzeby może być przydatne ponowne odwirowanie tych próbek, aby w późniejszym czasie odzyskać dodatkową tkankę lub DNA.
4. Do próbek tkankowych należy dodać 500 μl soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) i moczyć przez 1 godzinę w celu wymiany pozostałego etanolu konserwującego i rehydratacji próbki.
5. Próbki należy odwirować w wirówce stołowej przy 12 0 x g przez 20 minut. Roztwór PBS należy wylać do pojemnika na odpady częściowo wypełnionego roztworem dezynfekcyjnym.
6. Bakterialne DNA należy wyekstrahować za pomocą zestawu Qiagen DNEasy Blood and Tissue zgodnie z instrukcją.
7. Wyekstrahowane DNA należy podzielić na 4 alikwoty. Dwie alikwoty należy przechowywać w temperaturze -80°C do późniejszego wykorzystania, jeśli/kiedy wymagana będzie powtórność wyników testów lub gdy dostępne będą nowe technologie. Jedną alikwotę należy przechowywać w temperaturze -20°C, a jedną w 4°C do szybszego użycia.
8. Zaleca się przygotowanie „ślepej próby ekstrakcyjnej” wraz z próbkami tkankowymi. Próba ślepa jest poddawana wszystkim tym samym zabiegom opisanym powyżej, ale przeprowadzana jest bez tkanki. Należy wykonać reakcję PCR dla ślepej próby ekstrakcyjnej wraz z próbkami pacjentów, aby zagwarantować, że technika ekstrakcji operatora jest poprawna, a odczynniki są wolne od kontaminacji DNA.

2. Przygotowanie starterów

1. Startery dla loci, dla których dostępne są najobszerniejsze dane dotyczące typów szczepów, wymieniono w Tabeli 1. Do reakcji multiplex PCR łączy się od czterech do pięciu starterów. Jeden starter dla każdego locus posiada fluorescencyjny znacznik chemiczny na końcu 5', który jest wykrywany podczas analizy długości fragmentów (FLA) metodą elektroforezy kapilarnej.
2. Dla każdej kombinacji multiplex PCR znaczone startery oraz odpowiadające im startery odwrotne dla każdego locus umieszcza się w oddzielnych probówkach Eppendorf: startery bezpośrednie w jednej probówce, a odwrotne w drugiej. Roztwory stokowe starterów przygotowuje się w stężeniu 10μM (Rysunek 2a), z czego część rozcieńcza się 10-krotnie do stężenia 10 μM przy użyciu buforu TE (1x Tris-EDTA, pH 8.0). Pozostałe alikwoty roztworów starterów o stężeniu 10 μM przechowuje się w temperaturze -20°C do późniejszego użycia.
3. Równe ilości każdego startera o stężeniu 10 μM miesza się, uzyskując końcowe stężenie 2μM dla każdego startera. Po dodaniu kombinacji starterów do mieszaniny PCR (Tabela 3), końcowe stężenie każdego startera spada do 0.2 μM.

Po dodaniu połączonych starterów do mieszanin PCR (Tabela 3), ich stężenia końcowe spadają do 0.2μM dla każdego z nich.

3. Amplifikacja bakteryjnego DNA przy użyciu multiplex PCR

1. Przygotowanie do PCR
   • Zapisz liczbę próbek, które zostaną wykorzystane, i przygotuj arkusz z wymaganymi odczynnikami oraz ich objętościami przed zebraniem niezbędnych materiałów plastikowych i innych akcesoriów.
   • Oznacz numery próbek na sterylnych probówkach/paskach/płytkach przeznaczonych do PCR. Pamiętaj o uwzględnieniu kontroli dodatniej i ujemnej.
2. Przetrzyj termocykler roztworem czyszczącym (takim jak Decon ELIMINase) i zaprogramuj go zgodnie z Tabelą 2. Zmień rękawiczki po czyszczeniu i przed kontaktem ze starterami oraz innymi odczynnikami.
3. Przygotuj Mastermix do PCR zgodnie z Tabelą 3 i opisz probówki/paski/płytkę do PCR, podając kombinację starterów oraz numery próbek.
4. Odmij l po 18μl Mastermixu do każdej oznaczonej probówki lub dołka płytki PCR. Zmień rękawiczki.
5. Przetrzyj oddzielną komorę z laminarnym przepływem powietrza oraz pipety 70% etanolem, aby oczyścić i zdezynfekować obszar roboczy oraz narzędzia, a następnie naświetlaj obszar roboczy i pipety światłem UV przez 15 minut, aby usieciować wszelkie zanieczyszczenia DNA. Zmień rękawiczki.
6. W czystej komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 2μl matrycy DNA do Mastermixu w każdej probówce/dołku płytki PCR, aby uzyskać objętość całkowitą 20μl (Rysunek 2b). Do wszystkich materiałów ciekłych używaj końcówek do pipet z filtrem zapobiegającym tworzeniu się aerozolu.
7. Krótko odwiruj probówki/paski/płytki PCR, aby wymieszać zawartość.
8. Umieść probówki/paski/płytkę z próbkami w termocyklerze i uruchom program PCR.
9. Po zakończeniu programu wyjmij produkty z termocyklera i przechowuj w temperaturze 4°C do czasu przeprowadzenia elektroforezy.

4. Elektroforeza żelowa produktów PCR

*Niniejszy protokół jest stosowany standardowo od wielu lat i stanowi opcjonalny krok, który można wykorzystać, jeśli wymagane jest potwierdzenie produktów PCR przed ich przesłaniem do analizy FLA.

1. W oddzielnym obszarze roboczym po PCR przygotuj 2% żel agarozowy. W kolbie użyj 2,0g proszku agarozy na 10ml 1x buforu TBE (Tris/Borate/EDTA). Podgrzewaj mieszaninę w kuchence mikrofalowej przez około 1,5-2 minuty. Zamieszaj zawartość, w razie potrzeby ponownie podgrzewając, aby rozpuścić agarozę. Lekko przestudź i wlej żel do formy, używając grzebienia z odpowiednią liczbą dołków dla próbek.
2. Wyjmij produkty PCR z temperatury 4°C i wiruj przez około 30 sekund.
3. Wymieszaj 2-5μl produktu PCR z 0,5-1μl 5x lub 6x buforu do ładowania żelu (Bufor do ładowania jest dostępny w ofercie różnych firm lub może być przygotowany w laboratorium; receptury są dostępne online).
4. Nanieś 6μl mieszaniny próbki z buforem dołków żelu. Do jednego z dołków dodaj marker molekularny (najlepiej marker 20 bp).
5. Prowadź elektroforezę w żelu przy napięciu 10V przez około 90 minut.
6. Namocz żel w roztworze bromku etydium przez 15-30 minut, a następnie w ultreczystej wodzie destylowanej przez taki sam czas.
7. Wykonaj obrazowanie żelu przy naświetlaniu światłem UV. Powinien pojawić się prążek dla każdego z 4-5 segmentów DNA w kombinacji (Rycina 3).
8. Utylizuj żel zgodnie z polityką instytucji dotyczącą materiałów niebezpiecznych. Roztwór bromku etydium może być używany wielokrotnie przed właściwą utylizacją.

5. Przygotowanie próbek do analizy długości fragmentów (FLA)

1. W czystej probówce Eppendorf przygotować mieszaninę główną zawierającą 12μl roztworu formamidu Hi-Di ze świeżej aliquoty oraz 0,3μl standardu wielkości GeneScan -50 LIZ (oba od Applied BioSystems) dla każdej próbki do analizy. (Formamid Hi-Di chemicznie denaturuje nici DNA przed elektroforezą kapilarną, co eliminuje konieczność podgrzewania). Używając 96-dołkowej płytki reakcyjnej o jakości optycznej, nanieść 12,3μl mieszaniny formamidu i LIZ do każdego dołka przeznaczonego dla próbek i odstawić płytkę na bok.
2. Przygotować schemat rozmieszczenia próbek na płytce do celów dokumentacyjnych, wskazując, która próbka DNA znajduje się w każdym dołku (Rysunek 4a).
3. Używając probówek/pasek lub płytki 96-dołkowej, dodać 1μl produktu PCR (z Części 3) do 59μl wody o jakości PCR, tworząc rozcieńczenie produktu PCR w stosunku 1:60. Rozcieńczenia można dostosować w zależności od siły sygnału z danych FLA lub jasności prążków w żelu. Wystarczające mogą być nawet niższe stężenia DNA (1:120 lub 1:180).
4. Dodać 1μl rozcieńczonego produktu PCR do odpowiedniego dołka w płytce zawierającej mieszaninę formamidu i LIZ.
5. Prędkość i wydajność procesu można znacznie zwiększyć, jeśli reakcja PCR była również przeprowadzana w płytce 96-dołkowej. Można po prostu ustawić w linii trzy takie płytki sekwencyjnie: Płytka 1 z produktami PCR, Płytka 2 z wodą sterylną do rozcieńczenia produktów PCR oraz Płytka 3 z formamidem i drabiną wielkości do analizy długości fragmentów. Pipeta wielokanałowa umożliwia szybkie przygotowanie do analizy FLA.

Analiza próbek za pomocą analizatora genetycznego

6. Zkalibrować analizator genetyczny w celu detekcji zastosowanych fluoroforów zgodnie z instrukcją producenta. Należy upewnić się, że zestaw barwników zawiera LIZ.
7. Uzupełnić pojemniki do płukania wodą oraz dodać nowy bufor do elektroforezy (Running Buffer) z EDTA (1x) (Applied BioSystems) do komór buforowych.
8. Nałożyć na płytkę naciętą krzemową przegrodę (septum) i umieścić płytkę w odpowiedniej tacy. Nacisnąć przycisk „Tray” w analizatorze genetycznym, aby wysunąć autosampler. Umieścić tacę na autosamplerze i zamknąć drzwiczki analizatora genetycznego.
9. Utworzyć lub zaimportować arkusz kalkulacyjny do analizy. Pliki importowalne mają rozszerzenie .plt i są zapisane w formacie z rozdzielaczem tabulatorowym. Pliki można modyfikować w programie Excel (Microsoft) lub podobnych programach.
10. Próbki są wstrzykiwane do kapilary (długość 50 cm, polimer POP-7) poprzez przyłożenie napięcia wstrzykiwania 1,6 kV przez 15 s. Elektroforeza kapilarna przebiega przy napięciu 15 kV w temperaturze 60°C przez 180 sekund. Cały proces trwa około 45 minut.
11. Po zakończeniu przebiegu dane dla każdej analizowanej próbki są konwertowane na pliki z rozszerzeniem .fsa i umieszczane w folderze plików płytki (Rysunek 4b). Każdy plik danych ma rozmiar około 10 kB i może być zapisany na dysku flash, skompresowany i przesłany pocztą elektroniczną. Pliki danych można przeglądać za pomocą odpowiedniego oprogramowania, takiego jak GeneMapper lub Peak Scanner firmy ABI.

6. Analiza wyników długości fragmentów

1. Analiza danych z fluorescencyjnej elektroforezy kapilarnej wymaga specjalistycznego oprogramowania. Jeśli takie oprogramowanie nie jest dostępne, należy przejść na stronę internetową Applied BioSystems i pobrać program Peak Scanner. Oprogramowanie jest bezpłatne i działa bardzo dobrze. https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603624
2. Otwórz program Peak Scanner, wybierz opcję „Start New Project”, a następnie „Add Files”. Załaduj do programu wybrane pliki danych .fsa, w tym kontrole pozytywne i negatywne.
3. Zaznacz i „analizuj” wszystkie załadowane pliki. Upewnij się, że dla każdej próbki ustawiono „Size Standard: GS50(-250)” oraz „Analysis Method: Sizing Default-pp”. Naciśnij „Analyze”.
4. Określ wielkość w parach zasad każdego kolorowego piku wygenerowanego przez fragmenty DNA w próbkach.
5. Zapisz wartość wielkości każdego piku w parach zasad i porównaj ją z pikiem kontroli pozytywnej.
6. Piki w próbkach kontroli pozytywnej powinny być zgodne z liczbą par zasad i odpowiadającą im liczbą powtórzeń tandemowych wymienionymi w Tabelach 4-7.
7. Na podstawie porównania z kontrolą pozytywną określ, ile segmentów krótkich powtórzeń tandemowych występuje w każdym allelu próbki. Używamy NHDP63, dla którego zsekwencjonowano liczbę kopii VNTR w każdym badanym locusie.⁴
8. Wprowadź zapisane dane do arkusza kalkulacyjnego w celu przeprowadzenia analiz porównawczych i/lub matematycznych. „Odciski palców” VNTR lub haplotypy to ciągi alleli w określonych locusach, które są charakterystyczne dla szczepu M. leprae.

7. Reprezentatywne wyniki

Elektroforeza żelowa produktów PCR powinna w idealnym przypadku przynieść prążek dla każdego locus w kombinacji starterów (Rycina 3). Na Rycynie 3 żel podzielony jest na 2 sekcje: górna sekcja zawiera próbki PCR z kombinacji 1, a dolna próbki z kombinacji 2. Każda sekcja zawiera marker wielkości 20 par zasad, a następnie produkty PCR otrzymane z 8 próbek pacjentów. Kombinacja 1 zawiera również kontrolę negatywną oraz kontrolę pozytywną (szczep NHDP63). (Kontrole dla kombinacji 2 znajdowały się na innym żelu). Należy zauważyć, że w większości próbek wyraźnie widocznych jest 5 prążków, po jednym dla każdego locus w kombinacji. W niektórych przypadkach prążki mogą znajdować się zbyt blisko siebie, aby pojawić się jako oddzielne loci, co skutkuje widocznością tylko 4 prążków.

Oczekiwane rozmiary amplikonów wymieniono w Tabeli 1. Nasze laboratorium wykorzystuje szczep NHDP63 M. leprae jako kontrolę dodatnią. Badano dwa typy segmentów powtórzeń: loci mikrosatelitarne (z powtórzeniami od 1 do 5 zasad) oraz loci minisatelitarne (z segmentami dłuższymi niż 5 par zasad, powtórzonymi wielokrotnie). ⁵

Interpretacja plików danych z elektroforezy kapilarnej opiera się na 2 standardach: wewnętrznym standardzie wielkości fragmentów DNA zwanym GeneScan -500LIZ (ABI) oraz zewnętrznej próbce kontrolnej dodatniej zawierającej amplifikowany bakteryjny DNA.

Chromatogramy FLA, wyświetlone za pomocą oprogramowania Peak Scanner, przedstawiono na rycinach 5a, 5b i 6.

Peak Scanner dostarcza danych na temat wielkości amplikonu (oś x w parach zasad) oraz natężenia sygnału (oś y). (Rysunek 5b) Dostępne są również dodatkowe dane dotyczące pola powierzchni piku itp., choć najważniejsze są wartości wielkości i wysokości piku. Piki o wysokości poniżej 10 jednostek są zazwyczaj uznawane za sygnał zbyt słaby, aby był wiarygodny.

Rycina 6 porównuje kontrolę pozytywną (NHDP63) i dwie próbki od pacjentów, wykazując zmienność liczby powtórzeń tandemowych w locus (GTA)9. W kontroli pozytywnej sekwencja (GTA) powtarza się 10 razy. VNTR NHDP63 oraz wielkość amplikonu zostały zweryfikowane poprzez sekwencjonowanie genów. Amplikon PCR pacjenta 4 jest o 3 bp mniejszy od kontroli pozytywnej, co wskazuje na obecność jedynie 9 jednostek powtórzeń, natomiast pacjent 6 posiada amplikon o 3 bp większy niż NHDP63, co ujawnia 1 powtórzeń (GTA). Pacjent 2 wykazywał niski indeks bakteryjny (BI) przy niewielkiej lub braku replikacji DNA w PCR, w związku z czym nie odnotowano sygnału FLA.

Trudności w interpretacji danych FLA czasami wynikają z tzw. „jąkania” (stuttering). Podczas reakcji PCR polimeraza DNA może wytworzyć fragmenty, które są o jeden lub więcej powtórzeń dłuższe lub krótsze od allelu źródłowego. Są one zazwyczaj rozpoznawane jako szczyty o mniejszej wysokości otaczające szczyt główny. Będą one „na drabinie”, co oznacza, że będą większe lub mniejsze od szczytu głównego o prawidłową liczbę par zasad segmentu powtórzonego. Wynikiem jest rodzina szczytów w tym samym kolorze. Rycina 7 przedstawia to zjawisko dla locus (TA)10.

Kolejną trudnością czasami napotykaną w FLA jest zjawisko „+A” lub „dodawania ogona A” (A-tailing), polegające na dołączaniu przez polimerazę DNA pojedynczej zasady [zazwyczaj adeniny (A)] do końca 3' skopiowanego fragmentu DNA. W FLA objawia się to jako pik po prawej stronie piku głównego lub piku stutter, który jest większy o 1 parę zasad od piku sąsiedniego, co przedstawiono na Rysunku 8. Nie należy go mylić z pikiem głównym lub pikiem stutter. Pik główny wraz z jego ogonem A są uznawane za jeden gatunek. Ogon A nie zmienia liczby powtórzeń VNTR. (Niektóre zestawy polimerazy DNA są zaprojektowane tak, aby specyficznie promować dodawanie ogona A w celu zredukowania tego efektu zakłócającego. Promowanie pełnego dodawania ogona A ma tendencję do generowania pojedynczego piku zamiast pary pików).

Produkty ekstrakcji DNA i PCR zawierają zarówno DNA M. leprae, jak i ludzkie DNA, jednak z wyjątkiem (TA)18, primery są na tyle specyficzne, że amplifikują one wyłącznie DNA bakteryjne, a amplifikacja ludzkiego DNA jest niewielka lub nie występuje. (TA)18 często generuje piki przy 242 parach zasad pochodzące z ludzkiego DNA, których nie obserwuje się w próbkach DNA pasażowanych przez pancerniki (Rycina 9).

Okres trwałości starterów jest zazwyczaj długi, pod warunkiem że są one przechowywane w temperaturze -20°C, wyjmowane jedynie do natychmiastowego użycia, a następnie przechowywane w 4°C do momentu zużycia. Startery powinny pozostawać stabilne w 4°C przez 1-2 tygodnie. Mimo że przygotowywanie mieszanin starterów do PCR jest nieco czasochłonne, zaleca się przygotowanie jedynie takiej ilości mieszaniny, która zostanie wykorzystana niezwłocznie. Mieszaniny starterów wydają się ulegać częściowej degradacji podczas długotrwałego przechowywania.

Bufor TE należy rozdzielić z większych zapasów na mniejsze alikwoty, które można przechowywać w zamrożeniu lub w temperaturze pokojowej. Większe alikwoty o objętości 20-40μl nadają się do rozcieńczania liofilizowanych lub skoncentrowanych zapasów starterów (Rycina 2a). Mniejsze alikwoty o objętości 10-50 μl są przydatne do uzupełniania objętości kombinacji starterów 3 i 4. Bufor TE jest tani, a alikwoty należy utylizować po użyciu.

Zestawy enzymów do PCR multipleksowego są dość kosztowne i powinny być przechowywane w zamrożeniu (-20°C) do momentu użycia. Po przygotowaniu reakcji PCR wszystkie niewykorzystane roztwory do multipleksowania należy bezzwłocznie przenieść do temperatury 4°C. Mały zestaw Qiagen Multiplex PCR Kit zawiera 3 probówki z mieszanką do multipleksowania, z których każda zawiera 0,85 ml (850 μl) roztworu, co wystarcza na około 65-70 reakcji PCR.

Zasadniczo należy unikać powtarzających się, gwałtownych zmian temperatury materiałów wykorzystywanych w tego typu pracach laboratoryjnych, w tym próbek DNA, starterów oraz roztworów z zestawu do multiplex PCR. Wszystkie materiały powinny być przechowywane w temperaturze -20°C do momentu użycia, a następnie utrzymywane w temperaturze 4°C aż do zużycia. Przechowywanie DNA w dłuższym terminie powinno odbywać się w temperaturze -80°C.

Wszystkie materiały zawierające zużytą tkankę, primery i/lub DNA należy poddać autoklawowaniu i zutylizować, gdy nie będą już przydatne. Wszystkie próbki potraktowane bromkiem etydium lub formamidem należy traktować jako odpady niebezpieczne i utylizować zgodnie z polityką instytucji dotyczącą materiałów niebezpiecznych.

Tabela 1: Wielkości amplikonów dla szczepu NHDP63

Tabela 2: Parametry cykli dla PCR VNTR

Tabela 3: Przygotowanie do PCR

Tabela 4: Wywołania alleli dla kombinacji 1

Tabela 5: Wywołania alleli dla kombinacji 2

Tabela 6: Wywołania alleli dla kombinacji 3

Tabela 7: Wywołania alleli dla kombinacji 4

Rysunek 1Schemat blokowy procesu VNTR-FLA

Rycina 2. (a) Przygotowanie starterów górnych dla Kombinacji 1 (zdjęcie probówki Eppendorf dzięki uprzejmości www.clker.com). (b) Przygotowanie do PCR (dla 8 reakcji PCR) (zdjęcie probówki Eppendorf courtesy of www.clker.com)

Rycina 3Żel agarozowy z produktami PCR VNTR dla kombinacji 1 i 2

Rysunek 4. (a) Mapa płyty FLA. (b) Pliki danych FLA: *.fsa

Rysunek 5. (a) Chromatogram FLA kontroli pozytywnej (NHDP63) dla kombinacji 1 loci VNTR. (b) Skaner piku dane dotyczące wielkości i liczebności amplikonów (GTA)9

Rycina 6Porównanie próbek PCR z kontrolą pozytywną (NHDP63) dla locus (GTA)9

Rycina 7Piki główne i piki stutter dla (TA)10

Rycina 8Piki +A (ogon A) sąsiadujące z pikami głównymi lub stutterami.

Rysunek 9Główny pik (TA)18, piki stutter i pik DNA człowieka

Rycina 10: (A) Różnicowanie szczepów M. leprae na podstawie danych VNTR. (B) Różnicowanie szczepów M. leprae na podstawie MLVA (wielolocusowej analizy liczb powtórzeń) odcisków DNA

Dyskusja

Pobieranie próbek skóry od pacjentów z trądem wymaga udziału wykwalifikowanych klinicystów lub techników pracujących w klinikach dermatologicznych. Pracownicy laboratoryjni zajmujący się tymi próbkami muszą z najwyższą starannością stosować fartuchy laboratoryjne, rękawiczki oraz ochronę oczu, a podczas pracy z zakażonymi próbkami tkanek ludzkich lub tkanek pancernika korzystać z komory bezpiecznej biologicznie. Kluczowe jest również odkażanie powierzchni i narzędzi. Praca w czystej, sterylnej komorze bezpiecznej biologicznie jest istotna dla uniknięcia kontaminacji próbek DNA.

Ekstrakcja DNA stała się stosunkowo łatwa dzięki opracowaniu zestawów do izolacji przez firmy takie jak Qiagen. Należy ściśle przestrzegać instrukcji. Wszystkie próbki powinny być przechowywane w niskiej temperaturze, gdy nie są używane. Należy unikać wielokrotnych, gwałtownych zmian temperatury próbek.

Startery DNA wykorzystane w tej pracy można zamówić w różnych firmach, które zostały wymienione w bibliografii na końcu niniejszej publikacji. Należy zachować szczególną ostrożność i pracować ze starterami w środowisku wolnym od DNA, aby uniknąć kontaminacji. Startery są dostarczane w formie suchego proszku i muszą zostać rozpuszczone w buforze TE i rozcieńczone do stężenia 100μM, a następnie podzielone na mniejsze aلیکwoty (Rysunek 2a). Roztwory robocze starterów są następnie rozcieńczane do stężenia 10μM. Ponownie przypominamy, aby nie używać próbek DNA w obszarach lub dygestoriach, w których przygotowywane i stosowane są startery.

Produkty PCR powinny być również przechowywane w niskiej temperaturze, gdy nie są używane.

Przygotowanie żelu agarozowego o stężeniu 3% zapewnia lepszą separację prążków DNA, lecz wymaga dłuższego czasu elektroforezy. W celach czysto jakościowych zazwyczaj wystarczające jest stężenie 2%. Roztwór bromku etydyny stosowany do barwienia DNA w żelach agarozowych jest silnie aktywną genotoksyną, która wchłania się przez skórę. Należy obchodzić się z tym roztworem oraz z zabarwionymi nim żelami z ogromną ostrożnością, zawsze pamiętając o noszeniu rękawiczek. Po pracy z jakimikolwiek próbkami DNA lub materiałami zawierającymi bromek etydyny należy dokładnie umyć ręce. Roztwór barwiący z bromkiem etydyny, roztwory płuczące oraz żele należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Żele nie są wymagane rutynowo; ten krok można pominąć po ustanowieniu metod FLA. Jest on czasochłonny i zużywa odczynniki.

Roztwór formamidu stosowany do przygotowywania próbek do FLA jest również wysoce toksyczny i należy z nim obchodzić się ostrożnie. Po jego użyciu należy umyć ręce. Utylizację przeprowadzić zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

Odczytywanie wyników FLA przy użyciu oprogramowania Peak Scanner może być trudne. W CSU opracowano podstawowy zestaw oznaczeń alleli (liczba powtórzeń tandemowych) (Tabele 4-7). (Należy zauważyć, że Tabele 4-7 mogą nie być wyczerpujące. W miarę badania innych szczepów M. leprae mogą zostać znalezione allele z liczbą kopii wykraczającą poza wymienione zakresy). Jednym z szczególnych wyzwań są piki typu „stutter” (szum). Są to grupy pików, szczególnie w przypadku STR obejmujących powtórzenia zaledwie 2-3 par zasad, takich jak (TA)10. Czasami wybór właściwego piku do odczytu jest utrudniony (Rysunek 7). Na tym rysunku głównym pikiem w kontroli pozytywnej jest pik przy 190 bp. Piki o mniejszej wysokości, które są o 2, 4 lub nawet 6 par zasad większe lub mniejsze od piku głównego, nazywa się „pikami stutter”. Zamieszanie może również wprowadzić tzw. A-tailing. Zjawisko A-tailingu zostało opisane wcześniej w tekście oraz na Rysunku 8. Wreszcie, jeśli produkty PCR są w próbkach bardzo liczne, piki mogą pojawić się z podwójnym wierzchołkiem. W takim przypadku należy odczytać środek kształtu piku. (Patrz Rysunek 6, Pacjent 6).

Zarządzanie danymi w tego typu badaniach może być niezwykle wymagającym zadaniem. Ważne jest rejestrowanie wszystkich istotnych informacji dla każdego eksperymentu, takich jak: data wykonania zadania lub procedury, operator, mapy pasków/płytek, zamówienia FLA, warunki i składy mieszanin PCR, daty wykonania elektroforezy i wykonania zdjęć, temperatury przechowywania, rozcieńczenia matryc DNA, lokalizacje plików elektronicznych FLA itp. Dobra organizacja i zarządzanie danymi mogą zaoszczędzić wiele godzin poświęconych w przyszłości na poszukiwanie konkretnych informacji.

Opisane tutaj prace laboratoryjne są prowadzone od kilku lat na Colorado State University oraz w innych ośrodkach na całym świecie. Zaczyna wyłaniać się szerszy obraz tego, co oznaczają wszystkie zgromadzone dane i w jaki sposób mogą one być przydatne w przyszłości. Rysunki 10A oraz 10B pokazują, jak te odciski palców DNA mogą być wykorzystane do rozróżnienia różnych szczepów M. leprae pomiędzy krajami (10A) lub nawet pomiędzy rodzinami (10B). Wykazano, że przypadki powiązane rodzinie i społeczności niosą szczepy VNTR M. leprae o podobnych lub identycznych typach. Nadzieją jest, że uda się uzyskać dalszy wgląd w tryb(y) transmisji trądu, co pozwoli na opracowanie systemu wczesnego wykrywania sieci transmisji dla osób najbardziej narażonych oraz rozpoczęcie leczenia farmakologicznego przed wystąpieniem trwałych uszkodzeń neurologicznych i dermatologicznych.