1. Uwagi ogólne
- Zapoznaj się z Tabelą materiałów/wyposażenia, aby uzyskać listę niezbędnych odczynników. Wszystkie czynności należy wykonywać w ściśle określonych warunkach aseptycznych.
- Stosować inaktywowaną termicznie płodową surowicę bydlęcą (hiFBS) do wszystkich preparatów zawierających FBS. W celu inaktywacji termicznej należy ogrzać 50 ml porcji FBS w temperaturze 56 °C przez 30 minut, odwracając co 10 minut (patrz również Tabela 1).
nuta: Gdy FBS jest używany bez inaktywacji termicznej, fenotyp podobny do nabłonka postępuje szybciej w kulturach komórek SH-SY5Y.
- Przed użyciem należy odczekać, aż podłoże ogrzeje się i zrównoważy w inkubatorze, aby ustalić odpowiednią równowagę pH przed każdym krokiem. Na przykład pełne zrównoważenie 50 ml pożywki zajmuje około godziny (pH 7, 37 °C, 5% CO2).
nuta: Protokół ten wykorzystuje dwuetapową procedurę podziału, która wymaga trypsynizacji i ponownego platerowania częściowo zróżnicowanych komórek SH-SY5Y. Jest to stresujący proces dla tych wyjątkowo delikatnych komórek. Dlatego ważne jest, aby inkubować komórki w trypsynie przez minimalny czas. Pozwoli to na preferencyjne uniesienie neuronów, pozostawiając komórki podobne do nabłonka nadal przyczepione do naczynia.
- Przeprowadzić powolne rozcieranie zróżnicowanych komórek za pomocą plastikowej pipety o pojemności 10 ml z końcówką przylegającą do dna stożkowej rurki zawierającej komórki. Wykonuj rozcieranie z małą prędkością, w górę i w dół nie więcej niż pięć razy.
2. Rozmrażanie i hodowla niezróżnicowanych komórek nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y
- Przygotuj podstawowe podłoża wzrostowe.
- Szybko rozmrozić zamrożone komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C (około 2 min).
- Zawiesić komórki w 9 ml podstawowej pożywki wzrostowej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, a następnie odwirować przez 2 minuty przy 1 000 x g.
- Odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć granulowanych komórek, a następnie delikatnie zawiesić komórki w 10 ml podstawowej pożywki wzrostowej.
- Umieścić komórki w kolbie T-25 lub szalce o średnicy 60mm2.
- Następnego dnia wymień pożywkę, aby usunąć martwe komórki.
3. Dzień 0: Posiewanie komórek do różnicowania
- Rysunek 1 przedstawia schemat różnicowania.
- Przepłukać niezróżnicowane komórki 1x PBS, aspiratem, a następnie trypsynizować za pomocą 1-2 ml podgrzanego 1x 0,05% Trypsyny-EDTA.
- Gdy komórki znajdują się w trypszynie, inkubuj przez około 3 minuty w inkubatorze.
- Ugasić trypsynę, dodając 10 ml podstawowej pożywki wzrostowej, opłukać boki kolby lub naczynia i delikatnie rozcierać 1-3 razy. Przenieść zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Wirować przez 2 minuty przy 1,000 x g i zasysać pożywkę, uważając, aby nie naruszyć osadu.
- Zawiesić osad w 5 ml podstawowej pożywki wzrostowej i rozcierać 1-3 razy.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru, a następnie rozcieńcz za pomocą podstawowej pożywki wzrostowej do 50 000 komórek/ml.
- Umieść na płytce 2 ml komórek na szalkę o średnicy 35 mm2, co daje łącznie 100 000 komórek na szalkę i umieść z powrotem w inkubatorze.
4. Dzień 1: Zmień media (Differentiation Media #1)
- Podamy 50 ml pożywki różnicującej #1 (patrz Tabela 2) i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Po podgrzaniu podłoża należy pozostawić je do zrównoważenia w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) przez co najmniej jedną godzinę, aby ustalić właściwą równowagę pH przed użyciem.
- Dodaj kwas retinowy (RA) (patrz Tabela 1) do podgrzanych i zrównoważonych pożywek bezpośrednio przed dodaniem pożywki do potraw.
nuta: Kwas retinowy jest wrażliwy na światło i powinien być przechowywany w ciemnych butelkach w temperaturze 4 °C
- Delikatnie odessać stare podłoże i wyrzucić.
- Dodać 2 ml pożywki różnicującej #1 z RA na szalkę 35mm2 i ponownie umieścić w inkubatorze.
5. Dzień 3: Zmień media (Differentiation Media #1)
- Powtórz sekcję 4 (kroki 1-5)
6. Dzień 5: Zmień media (Differentiation Media #1)
- Powtórz sekcję 4 (kroki 1-5)
7. Dzień 7: Podział komórek 1:1
- Dodaj RA do podgrzanej i zrównoważonej pożywki różnicującej #1 bezpośrednio przed dodaniem pożywki do potraw.
- Delikatnie odessać stare podłoże i wyrzucić.
- Dodać 200 μl podgrzanego 0,05% 1x Trypsin EDTA na 35 mm2 naczynie i ogrzewać w inkubatorze przez około 2-3 minuty lub do momentu, gdy komórki zostaną widocznie podniesione z płytki, jak obserwowano pod mikroskopem.
- Ugasić trypsynę, dodając 2 ml pożywki różnicującej #1 z RA na naczynie 35 mm2 i użyć pożywki do wypłukania pozostałych komórek nerwowych z płytki. Następnie przenieść zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
nuta: Nie próbuj próbować zbyt wielu potraw na raz podczas etapów trypsynizacji. Pomaga to zapewnić, że kultury neuronalne nie są zbyt długo inkubowane w trypszynie, która może być cytotoksyczna.
- Połącz zawartość z maksymalnie 10 szalek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i delikatnie rozcieraj powoli w górę i w dół nie więcej niż pięć razy za pomocą plastikowej pipety o pojemności 10 ml.
- Podwielokrotność 2 ml zawiesiny komórek przelać na świeże szalki o średnicy 35 mm2 i ponownie umieścić w inkubatorze.
8. Dzień 8: Zmień media (Differentiation Media #2)
- Dodać RA (patrz Tabela 1) do podgrzanych i zrównoważonych pożywek bezpośrednio przed dodaniem pożywki do potraw.
- Delikatnie odessać stare podłoże i wyrzucić.
- Powoli dodawać 2 ml pożywki różnicującej #2 (patrz Tabela 2) z RA na szalkę 35mm2 i wrócić do inkubatora. Nie pozwól, aby neurony były wystawione na działanie powietrza przez dłuższy czas, ponieważ mogą szybko wyschnąć.
9. Dzień 9: Przygotuj potrawy pokryte matrycą zewnątrzkomórkową (ECM)
- Rozmrozić jedną fiolkę roztworu ECM na lodzie i rozcieńczyć w stosunku 1:100 do zimnego DMEM.
- Dozuj 2 ml mieszanki do każdej naczynia o średnicy 35 mm2 i upewnij się, że cała podstawa naczynia jest przykryta.
- Umieścić w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) na 1 godzinę lub na noc.
- Odessać mieszaninę i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez około 1 godzinę w kapturze. Przechowywać w temperaturze pokojowej do 2 miesięcy.
10. Dzień 10: Przenieś komórki na płytki powlekane ECM 1:1
- Dodać RA (patrz Tabela 1) do podgrzanych i zrównoważonych pożywek bezpośrednio przed dodaniem pożywki do potraw.
- Delikatnie odessać podłoże i wyrzucić.
- Dodaj 200 μl podgrzanej trypsyny do każdej płytki o średnicy 35mm2 i pozostaw do inkubacji w temperaturze pokojowej przez około 1-2 minuty lub do momentu, gdy neurony zostaną widocznie wyjęte z naczynia, jak obserwowano pod mikroskopem.
nuta: Wykonaj ten etap trypsynizacji w temperaturze pokojowej, aby uniknąć nadmiernej inkubacji neuronów trypsyną i powodowania uszkodzeń. Na tym etapie neurony uwalniają się z płytek znacznie szybciej niż komórki podobne do nabłonka.
- Ugasić trypsynę, dodając 2 ml pożywki różnicującej #2 na naczynie o średnicy 35mm2 i użyć pożywki do wypłukania pozostałych komórek nerwowych z płytki. Następnie przenieść zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Połącz zawartość z maksymalnie 10 szalek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i delikatnie rozcieraj powoli w górę i w dół nie więcej niż pięć razy za pomocą plastikowej pipety o pojemności 10 ml.
- Dozować 2 ml zawiesiny komórek do szalek 35 mm2 z powłoką ECM i ponownie umieścić w inkubatorze.
11. Dzień 11: Zmień media (Differentiation Media #3)
- Dodać RA (patrz Tabela 1) do podgrzanych i zrównoważonych pożywek bezpośrednio przed dodaniem pożywki do potraw.
- Delikatnie odessać stare podłoże i wyrzucić.
- Powoli dodawać 2 ml pożywki różnicującej #3 (patrz Tabela 2) z RA na szalkę 35mm2 i ponownie umieścić w inkubatorze. Nie pozwól, aby neurony były wystawione na działanie powietrza przez dłuższy czas.
12. Dzień 14: Zmień media (Differentiation Media #3)
- Powtórz sekcję 11 (kroki 1-3)
13. Dzień 17: Ostatnia zmiana mediów (Differentiation Media #3)
- Powtórz sekcję 11 (kroki 1-3)
14. Dzień 18: Kultury neuronalne gotowe do użycia
- Zmieniaj pożywkę na nową Pożywkę różnicującą #3 z RZS co 3 dni, aby utrzymać zdrowie neuronów.
nuta: Komórki powinny być zróżnicowane w neurony i wykazywać fenotyp neuronalny. Kultury są zazwyczaj stabilne do 14 dni po końcowym różnicowaniu. Jednak czas żywotności neuronów zależy od liczby pasaży niezróżnicowanych komórek na początku różnicowania. Wyższa liczba pasaży daje zróżnicowane neurony o krótszym czasie użytkowania.
Tabela 1: Roztwory podstawowe i składniki.
| składnik | Szczegóły | skład | Instrukcje |
| 10 μM RA | Kwas all-trans retinowy | 5 mM | Ponownie zawiesić 50 mg RA w 33,3 ml 95% EtOH. RZS jest wrażliwy na ciepło, światło i powietrze. Przechowywać w ciemnej butelce i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 tygodni. Stosować w rozcieńczeniu 1:500 i rozcieńczyć w pożywce różnicującej bezpośrednio przed użyciem |
| (300,44 g/mol) |
| 1x B-27 | Suplement B-27 | 50-krotnie | Rozmrozić butelkę o pojemności 1-10 ml i pozostałą część w jednorazowych podwielokrotnościach o pojemności 1 ml i przechowywać w temperaturze -80°C. Butelki o pojemności 10 ml przechowywać w temperaturze -20 °C |
| 20 mM KCl | Chlorek potasu | 1 mln | Dodaj 250 ml wody do 18,6 g KCl i sterylnego filtra. Przechowywać w temperaturze pokojowej |
| (74,55 g/mol) |
| 2 mM db-cAMP | dibutyryl cykliczny AMP | 1 mln | Zawieś pełną butelkę, dodając 2,04 ml wody do 1 g db-cAMP. Wrażliwy na światło i wilgoć. Przechowywać w porcjach 100 μl lub 200 μl w temperaturze -20 °C lub -80 °C |
| (491,37 g/mol) |
| 50 ng/ml BDNF | Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF) | - | Odwirować fiolkę, aby uzyskać proszek na dno. Zawiesić 10 μg fiolki w 1 ml Neurobasel + 1x B27 lub 5 μg w 0,5 ml Neurobasal + 1x B27, aby uzyskać 10 μg/ml. Stosować w rozcieńczeniu 1:200. Przechowywać porcje robocze w temperaturze -80 °C (np. 250 μl) |
| hiFBS powiedział: | Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca | - | Podwielokrotność rozmrożonego FBS w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Ogrzewać w temperaturze 56 °C w łaźni wodnej przez 30 min. Wyjąć i zamrozić robocze podwielokrotności w temperaturze -20 °C |
Tabela 2: Przepisy na media.
jedn.
| Podstawowe podłoże wzrostu |
| składnik | Pojemność na 500 ml | Rozcieńczeniu |
| EMEM (EMEM) | 415 ml EMEM | |
| 15% hiFBS | 75 ml hiFBS | |
| 1x długopis/paciorkowiec | 5 ml wstrzykiwacz/paciorkowiec | 1:100 |
| 2 mM Glutamina | 5 ml glutaminy | 1:100 |
| *Przechowywać maksymalnie przez 6 tygodni | |
| Media różnicujące #1 |
| składnik | Pojemność na 50 ml | Rozcieńczeniu |
| EMEM (EMEM) | 48 ml EMEM | |
| 2,5% hiFBS | 1,3 ml hiFBS | |
| 1x długopis/paciorkowiec | 500 μl wstrzykiwacz/paciorkowiec | 1:100 |
| 2 mM Glutamina | 500 μl glutaminy | 1:100 |
| 10 μM RA | 100 μl RA (zapas 5 mM) | 1:500 |
| *Przechowywać maksymalnie przez 2 tygodnie i dodać RA bezpośrednio przed użyciem |
| *Nie przechowuj dodatkowych nośników po dodaniu RA - RA jest niestabilny |
| Media różnicujące #2 |
| składnik | Pojemność na 50 ml | Rozcieńczeniu |
| EMEM (EMEM) | 49 ml EMEM | |
| 1% hiFBS | 500 μl hiFBS | |
| 1x długopis/paciorkowiec | 500 μl wstrzykiwacz/paciorkowiec | 1:100 |
| 2 mM Glutamina | 500 μl glutaminy | 1:100 |
| 10 μM RA | 100 μl RA (zapas 5 mM) | 1:500 |
| *Przechowywać maksymalnie przez 2 tygodnie i dodać RA bezpośrednio przed użyciem |
| *Nie przechowuj dodatkowych nośników po dodaniu RA - RA jest niestabilny |
| Media różnicujące #3 |
| składnik | Pojemność na 50 ml | Rozcieńczeniu |
| Neuropodstawowy | 47 ml Neurobasal | |
| 1x B-27 | 1 ml B-27 (50X bulionu) | 1:50 |
| 20 mM KCl | 1 ml KCl (zapas 1M) | 1:50 |
| 1x długopis/paciorkowiec | 500 μl wstrzykiwacz/paciorkowiec | 1:100 |
| 2 mM GlutamaxI | 500 μl GlutamaxI (100x zapas) | 1:100 |
| 50 ng/ml BDNF | 250 μl bulionu BDNF (10 μg/ml) | 1:200 |
| 2 mM cykliczny wzmacniacz dibutyrylu (db-cAMP) | 100 μl db-cAMP (zapas 1M) | 1:500 |
| 10 μM RA | 100 μl RA (zapas 5 mM) | 1:500 |
| *Przechowywać maksymalnie przez 2 tygodnie i dodać RA bezpośrednio przed użyciem |
| *Nie przechowuj dodatkowych nośników po dodaniu RA - RA jest niestabilny |
