Hodowla neuronów zwojowych siatkówki z glejem osłonki węchowej

Streszczenie

Źródło: Portela-Lomba, M., et al. Kokultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczkowym węchowym, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film pokazuje procedurę izolacji neuronów zwojowych siatkówki (RGN) z siatkówki szczura i kohodowli ich z komórkami glejowymi otoczki węchowej (OEG). Metoda ta pozwala na badanie potencjału neuroregeneracyjnego OEG po uszkodzeniu neuronalnym.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie ihOEG (Ts12 i Ts14) do testu

UWAGA: Ten krok musi być wykonany 24 godziny przed sekcją RGN i kokulturą.

1. Szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm należy traktować 10 μg/ml poli-L-lizyny (PLL) przez 1 godz.
   nuta: Szkiełka nakrywkowe można pozostawić na noc w roztworze PLL.
2. Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1x solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS).
3. Odłącz komórki Ts12 i Ts14 ihOEG od naczynia do hodowli komórek p60.
   1. Dodać 4 ml pożywki hodowlanej DMEM/F12 (podłoże podstawowe)-FBS (płodowa surowica bydlęca) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Ogrzewać w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
   2. Usunąć pożywkę z płytek i przemyć komórki 1 ml 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem)-EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) jeden raz.
   3. Dodać 1 ml trypsyny-EDTA do komórek OEG i inkubować przez 3–5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   4. Zebrać komórki za pomocą pipety p1000 i przenieść je do pożywki przygotowanej w kroku 2.1.
   5. Wirować przez 5 minut przy 200 x g.
   6. Aspiruj do supernatantu.
   7. Dodać 1 ml pożywki ME10 i ponownie zawiesić osad.
   8. Policz numer komórki w hemocytometrze.
4. Wysiać 80 000 komórek Ts14 lub 100 000 komórek Ts12 / basenik na szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowych płytkach w 500 μl pożywki ME10.
5. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 24 godziny.

2. Rozwarstwienie tkanki siatkówki

UWAGA: 2-miesięczne samce szczurów rasy Wistar są używane jako źródło RGN. Dwie siatkówki (jedna szczura) na 20 dołków 24-dołkowej płytki komórkowej. Autoklaw materiału chirurgicznego przed użyciem. Zestaw do dysocjacji papainy jest kupowany komercyjnie (tabela materiałów). Należy postępować zgodnie z instrukcjami dostawcy dotyczącymi rekonstytucji. Rozpuścić D, 2-amino-5-fosfonowalerianowy kwas (APV) w 5 mM podstawowym roztworze i przygotować podwielokrotności.

1. W dniu testu należy przygotować następujące podłoża.
   1. Przygotuj naczynie do hodowli komórek p60 z 5 ml zimnego EBSS (zbilansowany roztwór soli Earle'a) (fiolka 1 zestawu do dysocjacji papainy).
   2. Przygotować naczynie do hodowli komórek p60 z odtworzoną fiolką 2 (papainą) zestawu do dysocjacji papainy oraz 50 μl APV. Następnie dodać 250 μl odtworzonej fiolki 3 (DNaza plus 5 μL APV).
   3. W sterylnej probówce wymieszać 2,7 ml fiolki 1 z 300 μl fiolki 4 (inhibitor proteazy albuminowo-jajnikowej). Dodać 150 μl fiolki 3 (DNazy) plus 30 μl APV.
   4. Przygotuj 20 ml pożywki Neurobasal-B27 (NB-B27).
2. Złożyć ofiarę szczura przez uduszenie CO₂ .
3. Usunąć głowę przez ścięcie głowy gilotyną; umieścić ją na szalce Petriego o średnicy 100 mm i spryskać głowę etanolem o stężeniu 70% przed umieszczeniem jej w okapie z przepływem laminarnym.
4. Obetnij wąsy szczura nożyczkami, aby nie przeszkadzały w manipulacji oczami.
5. Chwyć nerw wzrokowy kleszczami, aby wyciągnąć gałkę oczną na tyle, aby móc wykonać nacięcie w poprzek oka skalpelem.
6. Usuń soczewkę i ciało szkliste i wyciągnij siatkówkę (tkankę podobną do pomarańczy), podczas gdy pozostałe warstwy oka (w tym warstwa nabłonka pigmentowego) pozostają w środku.
7. Umieść siatkówkę w naczyniu do hodowli komórkowej p60 przygotowanym w kroku 2.1.1.
8. Przenieść siatkówkę do naczynia do hodowli komórkowej p60 przygotowanego w kroku 2.1.2 i pokroić ją skalpelem na małe kawałki o przybliżonej wielkości < 1 mm.
9. Przenieść do plastikowej probówki o pojemności 15 ml.
10. Inkubować tkankę przez 30 minut w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO_{2 i} mieszając co 10 minut.
11. Dysocjuj grudki komórek, pipetując w górę i w dół za pomocą szklanej pipety Pasteura.
12. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut.
13. Odrzucić supernatant. Aby dezaktywować papainę, należy ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze przygotowanym w kroku 2.1.3 (1,5 ml na 2 oczy).
14. Ostrożnie odpipetować zawiesinę komórkową do 5 ml przygotowanej fiolki 4.
15. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
16. Podczas wirowania należy całkowicie usunąć pożywkę ME-10 z płytki kuwety OEG 24 dołkowej (wcześniej przygotowanej w kroku 1) i zastąpić ją 500 μl pożywki NB-B27 na dołek.
17. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki NB-B27.
18. Płytka 100 μl zawiesiny komórek siatkówki, na dołek płytki m24, na monowarstwy nakrywki poddane działaniu PLL lub OEG.
19. Utrzymywać kultury w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 96 godzin w pożywce NB-B27.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Suplement B-27	Gibco (firma Gibco)	17504044
Kwas D,L-2-amino-5-fosfonowalerianowy	Sigma	283967	Inhibitor receptora NMDA
Zobacz materiał DMEM-F12	Gibco (firma Gibco)	11320033	Pożywka do hodowli komórkowych
FBS (Sieć Usługowa	Gibco (firma Gibco)	11573397	Surowica bydlęca płodu
FBS-Hyklon	Fisher Naukowy	16291082	Surowica bydlęca płodu
L-glutamina	Lonza	BE17-605F
Podłoże nerwowo-podstawowe	Gibco (firma Gibco)	21103049	Pożywka do hodowli komórek nerwowych
System dysocjacji papainy	Korporacja Biochemiczna Worthington	LK003150	Do stosowania w izolacji komórek nerwowych
Pbs	Domowej roboty
PBS-EDTA	Lonza	H3BE02-017F
Penicylina/Streptomycyna/Amfoterycyna B	Lonza	17-745E	Działa bakteriostatycznie i bakteriobójczo
Ekstrakt z przysadki mózgowej	Gibco (firma Gibco)	13028014	Ekstrakt z przysadki bydlęcej
Poli-L- lizyna (PLL)	Sigma	A-003-M