Pomimo niedawnych postępów w modyfikacjach genetycznych, transfekcja ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HESCs) pozostaje procesem nieprzewidywalnym. Według naszej wiedzy, w literaturze nie opisano systematycznych i wydajnych metod transfekcji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs). W niniejszej pracy opisujemy niezawodne protokoły wydajnej transfekcji i nukleofekcji ludzkich iPSCs.
Artykuł metodologiczny
Transfekcja i nukleofekcja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Modyfikacje genetyczne pozostają kluczowym narzędziem w badaniu biologii komórek macierzystych oraz w opracowywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HESCs)1. Choć opisano ulepszenia w kilku metodach dostarczania genów2-9, transfekcja w przypadku HESCs wciąż pozostaje procesem nieprzewidywalnym, a w przypadku ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs) nie została jeszcze w pełni opisana. W tym filmie prezentujemy, jak w naszym laboratorium rutynowo przeprowadzamy transfekcję i nukleofekcję ludzkich iPSCs z wykorzystaniem plazmidu z reporterem białka zielonej fluorescencji (eGFP). Ludzkie iPSCs są adaptowane i hodowane w warunkach bezkarmiących (feeder-free), aby wyeliminować możliwość transfekcji komórek karmiących oraz umożliwić efektywną selekcję stabilnych transgenicznych klonów iPSC po transfekcji. W przypadku nukleofekcji, ludzkie iPSCs są wstępnie traktowane inhibitorem ROCK11, trypsynizowane do postaci małych skupisk komórek, nukleofektowane, a następnie wysiewane na komórki karmiące w pożywce warunkowanej przez komórki karmiące, aby zwiększyć przeżywalność komórek. Ludzkie iPSCs wykazujące ekspresję transgenu mogą zostać otrzymane po 6 godzinach. Selekcję antybiotykową stosuje się po 24 godzinach, a stabilne linie transgeniczne pojawiają się w ciągu 1 tygodnia. Nasz protokół jest skuteczny i powtarzalny dla linii ludzkich iPSC, nie wpływając na pluripotencjalność tych komórek.
Protokół
Nasz protokół rozpoczyna się od metody adaptacji ludzkich iPSC do kultur bez fibroblastów (feeder-free), a następnie obejmuje procedury transfekcji ludzkich iPSC przy użyciu GeneJuice (EMD) oraz nukleofekcji ludzkich iPSC z wykorzystaniem urządzenia AMAXA nuclefector.
Uwaga: Poniższe procedury są wykonywane w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wszystkie pożywki i roztwory są równoważone do 37°C lub temperatury pokojowej przed rozpoczęciem prac, chyba że zaznaczono inaczej.
1. Ustanawianie ludzkich iPSC w systemie bez komórek karmnych
Ludzkie iPSC, uprzednio hodowane na komórkach karmicielkach, można podzielić, przenieść na naczynie powleczone Geltrexem i utrzymywać przez dwa pasaże przed transfekcją w warunkach bez karmicielek.
- Rozmrozić Geltrex przez noc w temperaturze 4°C. Aby przygotować powłokę z Geltrex, rozcieńczyć rozmrożony Geltrex w stosunku 1:50 w zimnym DMEM. Delikatnie wymieszać roztwory.
Uwaga: Geltrex, podobnie jak Matrigel, jest rozpuszczalną formą macierzy błony podstawnej oczyszczoną z mysich komórek nowotworowych Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Alternatywnie, w celu ustanowienia kultur ludzkich iPSC bez komórek wspierających (feeder-free), można zastosować Matrigel jako macierz pozakomórkową.
- Pokryj całą powierzchnię studni hodowlanych roztworem Geltrex (1 ml dla studni o średnicy 35 mm). Pozostaw studnie pokryte Geltrexem w inkubatorze w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.
- Aby przeprowadzić pasaż ludzkich iPSC, dodaj 1 ml accutase do każdej studni i inkubuj w temperaturze 37°C przez 1 min, aż większość komórek zacznie się odklejać.
Aby przeprowadzić pasaż ludzkich iPSC, należy dodać 1 ml accutase do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37°C przez 1 min, aż większość komórek zacznie się odrywać.
- Do komórek dodać 10-15 szklanych kulek i delikatnie zakręcić płytką. Dodać 2 ml KnockOut DMEM/ F12 i delikatnie potryturyzować. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki do wirowania o pojemności 10 ml.
- Wirować komórki przy 80 rpm przez 3 min w temperaturze pokojowej.
- Odssać supernatant z probówki, pozostawiając nienaruszony osad ludzkich iPSC. Delikatnie uderzyć w probówkę, aby rozbić osad komórkowy.
- Usunąć Geltrex z powlekanej studni.
- Delikatnie resuspender osad ludzkich iPSC w odpowiedniej objętości STEMPRO. Rozdzielić między studnie z komórkami karmidłowymi, w zależności od tempa proliferacji. Ludzkie iPSC można pasażować w stosunku rozcieńczenia od 1:2 do 1:6.
- Ostrożnie umieścić w inkubatorze z 5% CO2, delikatnie zakręcić płytką, aby zapewnić równomierny rozkład komórek w studniach.
- Dokarmiać komórki codziennie, aż będą gotowe do ponownego pasażowania (gdy komórki osiągną 80% konfluencji).
- Pasażować ludzkie iPSC do nowej studni powlekanej Geltrexem (kroki 1.3 do 1.9) w stosunku rozcieńczenia 1:2. Przed transfekcją na studni powlekanej Geltrexem powinny utworzyć się małe kolonie, rozmieszczone równomiernie.
2. Transfekcja ludzkich iPSC przy użyciu GeneJuice
Komórki (hodowane na płytkach 6-dołkowych) w dniu transfekcji powinny osiągnąć około 40–50% konfluencji, aby uzyskać optymalną wydajność transfekcji. Wymiana pożywki komórkowej nie jest konieczna aż do następnego dnia.
- Przygotuj 10 μl KO-DMEM/F12 w sterylnej probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Dodaj 27 μl odczynnika do transfekcji GeneJuice. Wymieszaj dokładnie. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 min.
- Dodaj 4 μg plazmidowego DNA. Inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez 15 min. Wybór plazmidu jest kluczowy dla optymalnej wydajności transfekcji. Stosujemy plazmid zawierający białko zielonej fluorescencji o zwiększonej intensywności (eGFP) pod kontrolą promotora CAG5 (pCAG-eGFP). Promotor CAG jest silnym promotorem, który jest aktywny transkrypcyjnie w ludzkich iPSC, a zatem może być wykorzystany do sterowania ekspresją transgenu w tych komórkach. W naszych badaniach linearyzacja plazmidu nie wydawała się wpływać na wydajność transfekcji.
- Dodaj mieszaninę GeneJuice-DNA do komórek i delikatnie zakręć płytką. Wiruj płytkę przy 1200 rpm przez 5 minut (metoda „spinokulacji”), aby zwiększyć kontakt mieszaniny transfekcyjnej z ludzkimi iPSC w dołku.
- Inkubuj komórki w temperaturze 37°C przez noc.
- Następnego dnia monitoruj wydajność transfekcji.
- W przypadku transfekcji stabilnej, następnego dnia wymień medium na świeże STEMPRO. Po 24–48 godzinach dodaj odpowiedni antybiotyk selekcyjny.
3. Nukleofekcja ludzkich iPSC
Ludzkie iPSC hodowane na komórkach feederowych lub Geltrex mogą być wykorzystywane do nukleofekcji. Jednakże zdecydowanie zalecamy ponowne wysiewanie nukleofektowanych ludzkich iPSC na feederach z embrionalnych fibroblastów mysich (MEF) lub fibroblastów prątków ludzkiej przesłonki (HFF), aby zapewnić wysoką żywotność i regenerację komórek. W celu uzyskania wyższej przeżywalności komórek po nukleofekcji należy użyć co najmniej 2 milionów komórek.
- Przygotować pożywkę warunkowaną (CM) z komórkami karmicielami poprzez inkubację pożywki KOSR (human iPSC KnockOut Serum Replacement) z komórkami karmicielami przez noc. Pobierać CM co 24 godziny.
Uwaga: Każda szczep myszy używana do przygotowywania warstw pożywczych (np. BLK6, CF1 i MF1) nadaje się do wytwarzania CM.
- W dniu nukleofekcji poddać ludzkie iPSC działaniu 10 μM inhibitora ROCK przez co najmniej 1 godzinę.
- Przygotować 82 μl roztworu do nukleofekcji komórek macierzystych człowieka w sterylnej probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml. Dodać 18 μl suplementu 1. Dokładnie wymieszać. Inkubować roztwór w temperaturze 37°C przez 5 minut.
- Podgrzać do 37°C pożywkę warunkowaną komórkami karmidłowymi (CM) oraz 0,25% trypsynę/EDTA. W komorze z laminarnym przepływem powietrza odpowiednio opisać jedną sterylną probówkę stożkową o pojemności 15 ml.
- Ostrożnie usunąć pożywkę z hodowli ludzkich iPSC przeznaczonych do nukleofekcji. Delikatnie przemyć komórki 2 ml 1X roztworu buforu fosforanowego (PBS) na studzienkę. Odessać PBS. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny na studzienkę. Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez 3 minuty.
- Delikatnie triturować komórki za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 μl. Przemyć dno studzienki, aby upewnić się, że wszystkie ludzkie iPSC zostały całkowicie odklejone. Przenieść zawiesinę komórkową do opisanej probówki stożkowej 15 ml.
Uwaga: Należy ściśle unikać trypsynizacji do pojedynczych komórek. Komórki powinny być oddzielane jedynie w postaci małych skupisk składających się z w przybliżeniu trzech komórek. Małe skupiska komórek (triplety komórkowe) ulegną dysocjacji do pojedynczych komórek podczas dalszej obróbki.
- Dodaj 9 ml pożywki MEF, aby dezaktywować trypsynę. Wirować komórki przy 800 rpm przez 3 min. Ostrożnie odessać nadsącz, pozostawiając nienaruszony pellet komórkowy.
- Resuspendować komórki w podgrzanych do odpowiedniej temperatury 10 μl roztworu do nukleofekcji ludzkich komórek macierzystych z kroku 3.3.
- Przenieść komórki do kuwety nukleofektora za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.
- Dodać 4 μg plazmidowego DNA do zawiesiny komórkowej w kuwecie. Wymieszać komórki i DNA delikatnie potrząsając kuwetą. Dwukrotnie uderzyć kuwetą o powierzchnię dygestorium.
- Włożyć kuwetę do uchwytu nukleofektora. Użyć programu B-016. Przeprowadzić nukleofekcję komórek, naciskając przycisk X.
<> pojawi się po zakończeniu procesu nukleofekcji (zwykle trwa on tylko 1–5 sekund). Zastosowanie innych programów nukleofekcji (A-023, A-03 i U-023) pozwoliło uzyskać mniej niż 10% komórek eGFP-dodatnich z ludzkich iPSC.
- Odbierz nukleofektowane komórki z kuwety, używając dołączonej plastikowej pipety Pasteura. Odzyskaj komórki, resuspendując je w uprzednio ogrzanym CM i inhibitorze ROCK w sterylnej probówce Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Inkubuj komórki w temperaturze 37°C przez 10 min, aby umożliwić ich regenerację.
- Przenieś komórki kroplami na warstwy komórek karmicieli, używając końcówki do pipety 1 ml. Inkubuj komórki w temperaturze 37°C przez noc.
- Następnego dnia sprawdź wydajność transfekcji. Aby wyizolować stabilne klony transgenicznych ludzkich iPSC stabilnie wykazujących ekspresję transgenu, wymień następnego dnia medium na CM z inhibitorem ROCK. Po 24–48 godzinach dodaj odpowiedni antybiotyk do selekcji.
4. Reprezentatywne wyniki:
Rycina 1. Mikrofotografie ludzkich iPSC Riv1 przetransfekowanych pCAG-eGFP. (A) Komórki Riv1 wykazujące ekspresję eGFP, przetransfekowane za pomocą GeneJuice na Geltrex 12 godzin po transfekcji. Kolonie ludzkich iPSC Riv1 wysiane i uformowane na komórkach dokarmiających po nukleofekcji z zastosowaniem programu B-016 (B) oraz A-023 (C). (D) Kolonie ludzkich iPSC ze stabilną ekspresją eGFP z powszechną ekspresją eGFP uzyskaną za pomocą GeneJuice. (E) Stabilnie przetransfekowane ludzkie iPSC Riv1 zachowały konstytutywną ekspresję eGFP podczas różnicowania w ciała embrionalne.
Dyskusja
Nasze protokoły pozwalają na zastosowanie prostych, solidnych i wysoce powtarzalnych technik wprowadzania transgenów do ludzkich iPSC bez występowania wyraźnych efektów toksycznych i śmierci komórkowej. Ludzkie iPSC powinny być pasażowane w formie małych skupisk komórek (5-10 komórek) i wysiewane na Geltrex z wysoką gęstością (1:2), aby zapewnić optymalną wydajność transfekcji w licznych małych koloniach. W przypadku linii ludzkich iPSC bardziej podatnych na różnicowanie i śmierć komórkową, do jednego eksperymentu z nukleofekcją należy użyć większej liczby ludzkich iPSC (do 4 X 106 komórek). Test transfekcji przejściowej generuje dużą liczbę ludzkich iPSC wykazujących ekspresję transgenu w ciągu 1 dnia. Stabilnie transfektowane klony iPSC pojawiają się zazwyczaj w ciągu 7 dni, a te kolonie transgeniczne powinny być gotowe do wyselekcjonowania w ciągu trzech tygodni. Zastosowanie opisanego tutaj promotora CAG zapewnia powszechną ekspresję reportera eGFP. Dzięki takim usprawnieniom nasze protokoły mogą być wykorzystywane w innych zastosowaniach, w tym do nadekspresji, indukcji warunkowej, wyprowadzania linii reporterowych specyficznych dla danej linii komórkowej, wyciszania za pomocą shRNA lub siRNA, celowania w geny oraz rekombinacji homologicznej.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Prace opisane w niniejszym manuskrypcie były możliwe dzięki finansowaniu z California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) dla UCR Stem Cell Core.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,25% trypsyny z EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 2-merkapto–etanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| szklane kuleczki 3 mm | Fisher Scientific | 11-312A | Szklane kuleczki należy myć kwasem solnym (HCl) przez noc, przepłukać wodorotlenkiem sodu (NaOH) i wodzie destylowanej, a następnie wysterylizować w autoklawie przed użyciem. |
| odczyn do dysocjacji komórek Accutase | Invitrogen | A11105-01 | |
| podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) | Invitrogen | PHG0263 | |
| DMEM (wysoka zawartość glukozy) | Lonza Inc. | 12-741 F | |
| płodowa surowica cielęca | Invitrogen | 16000044 | |
| Geltrex | Invitrogen | 12760013 | z obniżoną zawartością czynników wzrostu |
| odczyn do transfekcji GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | |
| Glutamax-I (100X) | Invitrogen | 35050061 | Zamiast niego można również stosować L-glutaminę (Invitrogen, 25030081). |
| pożywka KOSR dla ludzkich iPSC | 500 ml pożywki dla ludzkich ES składa się z 390 ml KnockOut DMEM/F12, 100 ml zamiennika surowicy KnockOut, 5 ml Glutamax-I (100X), 5 ml NEAA (100X), 500 μl 2-merkapto–etanolu (55mM) i jest uzupełniona o 10 ng/ml bFGF. | ||
| KnockOut DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | |
| zamiennik surowicy KnockOut (KOSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| pożywka dla embrionalnych fibroblastów mysich | pożywka MEF składa się z 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I i 1X pirogronianu sodu w DMEM (wysoka zawartość glukozy) | ||
| niezbędne aminokwasy, NEAA (100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| roztwór nuklefektora 1 dla ludzkich komórek macierzystych z suplementem | Lonza Inc. | VAPH-5012 | |
| fosforanowy bufor solny bez Ca2+ i Mg2+ | Invitrogen | 10010023 | |
| pirogronian sodu (100X) | Invitrogen | 11360070 | |
| zestaw pożywkowy STEMPRO | Invitrogen | A1000701 | 500 ml pożywki STEMPRO składa się z 454 ml KnockOut DMEM/F12, 10 ml bezsurowiczego suplementu wzrostowego STEMPRO (50X), 5 ml Glutamax-I (100X), 5 ml NEAA (100X), 36 ml BSA (albumina surowicy bydlęcej, 25%), 909 μl 2-merkapto–etanolu (55mM) i jest uzupełniona o 10 ng/ml bFGF. |
Bibliografia
- Liew, C. G. Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation. Ann Med. 37, 521-532 (2005).
- Eiges, R. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homogous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).
- Siemen, H. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
- Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives. Stem Cells. 26, 525-533 (2008).
- Braam, S. R. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).
- Braam, S. R. Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification. Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).
- Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).
- Placantonakis, D. G. BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage. Stem Cells. 27, 521-532 (2009).
Przedruki i uprawnienia
