$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Nasz protokół rozpoczyna się od metody adaptacji ludzkich iPSC do hodowli bez komórek karmionek, a następnie zawiera protokoły transfekcji ludzkich iPSC z użyciem GeneJuice (EMD) oraz nukleofekcji ludzkich iPSC przy użyciu urządzenia AMAXA nuclefector.
Uwaga: Poniższe procedury są wykonywane w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wszystkie pożywki i roztwory są równoważone do 37°C lub temperatury pokojowej przed rozpoczęciem prac, chyba że zaznaczono inaczej.
1. Ustanawianie ludzkich iPSC w systemie bez komórek karmionek
Ludzkie iPSC, uprzednio hodowane na komórkach karmicielskich, można podzielić, przenieść na naczynie pokryte Geltrexem i utrzymywać przez dwa pasaże przed przeprowadzeniem transfekcji w warunkach bezkomórkowych (feeder-free).
- rozmrozić Geltrex przez noc w temperaturze 4°C. Aby przygotować powłokę z Geltrex, rozcieńczyć rozmrożony Geltrex w stosunku 1:50 w zimnej pożywce DMEM. Roztwory delikatnie wymieszać.
Uwaga: Geltrex, podobnie jak Matrigel, jest rozpuszczalną formą macierzy błony podstawnej oczyszczoną z mysich komórek guza Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Alternatywnie, do tworzenia kultur ludzkich iPSC bez warstw komórek odżywek można wykorzystać Matrigel jako macierz zewnątrzkomórkową.
- Pokryć całą powierzchnię dołków hodowlanych roztworem Geltrex (1 ml na dołek 35-mm). Inkubować dołki pokryte Geltrex w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.
- W celu pasażowania ludzkich iPSC, dodać 1 ml accutase do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37°C przez 1 min, aż większość komórek zacznie się odrywać.
Aby przeprowadzić pasaż ludzkich iPSC, dodaj 1 ml accutase na studnię i inkubuj w temperaturze 37°C przez 1 min, aż większość komórek zacznie się odklejać.
- Do komórek dodać 10-15 szklanych kulek i delikatnie zakręcić płytką. Dodać 2 ml KnockOut DMEM/ F12 i delikatnie utrityrować. Zawiesinę komórkową przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 10 ml.
- Wirować komórki przy 800 rpm przez 3 min w temperaturze pokojowej.
- Odssać nadosad z probówki, pozostawiając nienaruszony osad ludzkich iPSC. Delikatnie uderzyć w probówkę, aby rozbić osad komórkowy.
- Usunąć Geltrex z powleczonego dołka.
- Delikatnie resuspendować osad ludzkich iPSC w odpowiedniej objętości STEMPRO. Rozdzielić między dołki z komórkami karmionymi, w zależności od szybkości proliferacji). Ludzkie iPSC można pasażować w stosunku rozcieńczenia od 1:2 do 1:6.
- Ostrożnie umieścić w inkubatorze z 5% CO2, delikatnie zakręcić płytką, aby zapewnić równomierny rozkład komórek w dołkach.
- Dokarmiać komórki codziennie, aż będą gotowe do ponownego pasażowania (gdy osiągną 80% konfluencji).
- Pasażować ludzkie iPSC do nowego dołka powleczonego Geltrexem (kroki 1.3 do 1.9) w stosunku rozcieńczenia 1:2. Przed transfekcją w dołku powleczonym Geltrexem powinny utworzyć się małe kolonie, rozmieszczone równomiernie.
2. Transfekcja ludzkich iPSC za pomocą GeneJuice
Komórki (hodowane na płytkach 6-dołkowych) powinny osiągnąć w dniu transfekcji stopień konfluencji około 40-50%, aby uzyskać optymalną wydajność transfekcji. Wymiana pożywki komórkowej nie jest konieczna aż do następnego dnia.
- Przygotować 100 μl KO-DMEM/F12 w sterylnej probówce Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Dodać 27 μl odczynnika do transfekcji GeneJuice. Dobrze wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
- Dodać 4 μg plazmidowego DNA. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 15 min. Wybór plazmidu ma kluczowe znaczenie dla optymalnej wydajności transfekcji. Stosujemy plazmid z białkiem fluorescencyjnym eGFP pod kontrolą promotora CAG5 (pCAG-eGFP). Promotor CAG jest silnym promotorem aktywnym transkrypcyjnie w ludzkich iPSC, dzięki czemu może być wykorzystywany do sterowania ekspresją transgenu w tych komórkach. W naszych badaniach linearyzacja plazmidu nie wydawała się wpływać na wydajność transfekcji.
- Dodać mieszaninę GeneJuice-DNA do komórek i delikatnie zakręcić płytką. Wirować płytkę z prędkością 1200 rpm przez 5 minut (metoda „spinokulacji”), aby zwiększyć kontakt mieszaniny transfekcyjnej z ludzkimi iPSC w studniach.
- Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez noc.
- Następnego dnia ocenić wydajność transfekcji.
- W przypadku transfekcji stabilnej, następnego dnia wymienić pożywkę na świeży STEMPRO. Po 24–48 godzinach dodać odpowiedni antybiotyk selekcyjny.
3. Nuklefekcja ludzkich iPSC
Ludzkie iPSC hodowane na warstwach komórek feeder lub Geltrex mogą być wykorzystane do nukleofekcji. Zaleca się jednak ponowne wysianie nukleofektowanych ludzkich iPSC na warstwy embrionalnych fibroblastów myszy (MEF) lub fibroblastów z ludzkiego napletka (HFF), aby zapewnić wysoką żywotność i regenerację komórek. W celu uzyskania wyższego przeżycia komórek po nukleofekcji należy użyć co najmniej 2 milionów komórek.
- Przygotować pożywkę warunkującą (CM) z komórek karmicieli poprzez inkubowanie pożywki iPSC KnockOut Serum Replacement (KOSR) z komórkami karmicielami przez noc. Zbierać CM co 24 godziny.
Uwaga: Każda szczep myszy używana do przygotowania warstw komórek karmionek (takich jak BLK6, CF1 i MF1) nadaje się do sporządzania CM.
- W dniu nukleofekcji poddaj ludzkie iPSC wstępnej obróbce z użyciem 10 μM inhibitora ROCK przez co najmniej 1 godzinę.
- Przygotuj 82 μl roztworu do nukleofekcji ludzkich komórek macierzystych w sterylnej probówce Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Dodaj 18 μl suplementu 1. Wymieszaj dokładnie. Inkubuj roztwór w temperaturze 37°C przez 5 min.
- Podgrzej do 37°C pożywkę warunkowaną komórkami feeder (CM) oraz 0,25% trypsynę/EDTA. W komorze z laminarnym przepływem powietrza oznakuj jedną sterylną probówkę stożkową o pojemności 15 ml.
- Ostrożnie usuń pożywkę z hodowli ludzkich iPSC przeznaczonych do nukleofekcji. Delikatnie przemyj komórki 2 ml 1X roztworu buforu fosforanowego (PBS) na każdą studzienkę. Odessaj PBS. Dodaj 1 ml 0,25% trypsyny na studzienkę. Inkubuj komórki w temperaturze 37°C przez 3 min.
- Delikatnie utrzyturuj komórki za pomocą końcówki pipety 1000 μl. Przemyj dno studzienki, aby upewnić się, że wszystkie ludzkie iPSC zostały całkowicie odklejone. Przenieś zawiesinę komórkową do oznakowanej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.
Uwaga: Należy ściśle unikać trypsynizacji do pojedynczych komórek. Komórki powinny być odrywane jedynie w postaci małych skupisk składających się z około trzech komórek. Małe skupiska komórek (triplety komórkowe) zostaną rozdzielone na pojedyncze komórki podczas kolejnych etapów ich przetwarzania.
- Dodaj 9 ml pożywki MEF, aby inaktywować trypsynę. Wiruj komórki przy 800 rpm przez 3 mins. Ostrożnie odessaj nadsącz, pozostawiając nienaruszony osad komórkowy.
- Resuspenduj komórki w podgrzanych do odpowiedniej temperatury 100 μl roztworu do nukleofekcji ludzkich komórek macierzystych z kroku 3.3.
- Przenieś komórki do kuwety do nukleofektora za pomocą końcówki do pipety 1 ml.
- Dodaj 4 μg plazmidowego DNA do zawiesiny komórkowej w kuwecie. Wymieszaj komórki i DNA, delikatnie potrząsając kuwetą. Dwukrotnie stuknij kuwetą o powierzchnię dygestorium.
- Wsuń kuwetę do uchwytu nukleofektora. Użyj programów B-016. Przeprowadź nukleofekcję komórek, naciskając przycisk X.
<> zostanie wyświetlone po zakończeniu procesu nukleofekcji (zazwyczaj trwa to tylko 1-5 sekund). Zastosowanie innych programów nukleofekcji (A-023, A-033 i U-023) doprowadziło do uzyskania mniej niż 10% komórek eGFP-dodatnich z ludzkich iPSCs.
- Pobrać nukleofektowane komórki z kuwety za pomocą dołączonej plastikowej pipety Pasteura. Odzyskać komórki, resuspendując je w uprzednio ogrzanym CM i inhibitorze ROCK w sterylnym probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez 10 min w celu ich regeneracji.
- Przenieść komórki kroplami na warstwy karmione (feeder layers) za pomocą końcówki pipety 1 ml. Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez noc.
- Następnego dnia ocenić wydajność transfekcji. Aby uzyskać stabilne klony transgenicznych ludzkich iPSC stabilnie wykazujących ekspresję transgenu, następnego dnia wymienić medium na CM z inhibitorem ROCK. Po 24–48 godzinach dodać odpowiedni antybiotyk do selekcji.
4. Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 1. Mikrofotografie ludzkich iPSC Riv1 przetransfekowanych wektorem pCAG-eGFP. (A) Komórki Riv1 wykazujące ekspresję eGFP, przetransfekowane za pomocą GeneJuice na Geltrex 12 godzin po transfekcji. Kolonie ludzkich iPSC Riv1 wysiane i uformowane na komórkach karmiących po nukleofekcji z użyciem programów B-016 (B) oraz A-023 (C). (D) Kolonie ludzkich iPSC ze stabilną i powszechną ekspresją eGFP uzyskaną dzięki GeneJuice. (E) Stabilnie przetransfekowane ludzkie iPSC Riv1 zachowały konstytutywną ekspresję eGFP podczas różnicowania w ciała embrionalne.