Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami, a komisja weterynaryjna JoVE dokonała przeglądu wszystkich procedur dotyczących modeli zwierzęcych.
1. Krycia czasowe
- Miejsce ISLMN:GFP (Islet Motor Neuron Green Fluorescent Protein; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J Nr magazynowy: 017952) samce i samice myszy razem przez noc. Zważ samice i zapisz wagę przed kryciem.
UWAGA: ISLMN: GFP specjalnie znakuje neurony ruchowe farnezylowanym GFP, który nie jest cytotoksyczny, lokalizuje się w błonie komórkowej neuronów ruchowych i ich aksonów oraz umożliwia wizualizację nerwów podczas rozwoju. Można również użyć innych linii znakowanych fluorescencyjnie.
- Sprawdź, czy nie ma zatyczek dopochwowych wczesnym rankiem. Data zidentyfikowania wtyczki jest oznaczona jako E0.5.
- Potwierdzić ciążę za pomocą przyrostu masy ciała i/lub badania ultrasonograficznego w 10,5 dniu zarodkowym (E10,5). Ciężarne matki powinny przybrać na wadze co najmniej 1 g. Zarodki można zobaczyć w badaniu ultrasonograficznym pod kątem E10,5.
2. Przygotowanie odczynników i wibratomu do hodowli plastrów
- Przygotuj 500 ml buforu do krojenia: dodaj 5 ml kwasu HEPES (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego) i 5 ml penicyliny/streptomycyny do 500 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) bez Ca2+ i Mg2+. Schłodzić do 4 °C.
nuta: Dodatkowy bufor do krojenia powinien być przechowywany w temperaturze 4 °C i może być wykorzystany do przyszłych eksperymentów z kulturami plastrów.
- Przygotuj 50 ml pożywki hodowlanej: W sterylnym kapturze dodaj 12,5 ml HBSS, 12,5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 250 μl glukozy, 250 μl L-glutaminy, 125 μl HEPES do 24,4 ml Fluorobright DMEM (zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco). (Stężenia końcowe: FlouroBright DMEM z 25% HBSS, 25% FBS, 0,5% glukozy, 1 mM glutaminy i 2,5 mM HEPES.). Ogrzać pożywkę hodowlaną do temperatury 37 °C w sterylnej łaźni wodnej.
nuta: Pożywki hodowlane można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni.
- W sterylnym kapturze dodaj 1,5 ml pożywki hodowlanej do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Dodaj wkładkę do hodowli komórkowej (tabelę materiałów) do każdej studzienki. Umieścić w sterylnym inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Przygotować 4% agarozy o niskiej temperaturze topnienia: rozpuść 2 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 50 ml sterylnego PBS. Kuchenka mikrofalowa w odstępach 30-60 s, aż do całkowitego rozpuszczenia. Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C, aby utrzymać płyn.
nuta: Dodatkowa agaroza może być przechowywana w temperaturze pokojowej (RT) i topiona do przyszłych eksperymentów z kulturami plastrów.
- Skonfiguruj wibratom: Umieść nowe ostrze na wibratomie. Sprawdź ustawienia: grubość 400-450 μm. Wstępnie schłodź etap wibratomowy. Umieść trochę lodu w zewnętrznej komorze. Skorzystaj z komory i sceny poświęconej żywym plastrom. Nie używaj tej samej komory wibratomu do utrwalenia tkanki, ponieważ resztkowy utrwalacz może być szkodliwy dla plastrów.
- Przygotować górny inkubator ze stopniem mikroskopu do temperatury 37 °C i 5% CO2 .
- Przygotuj się do sekcji: Oczyść narzędzia chirurgiczne i spryskaj 70% etanolem. Napełnij dwie szalki Petriego HBSS, umieść na lodzie. Otwórz 12-dołkową płytkę do hodowli tkankowej i umieść pokrywkę na lodzie spodem skierowanym do góry. Otwórz 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej i umieść wkładki błony do hodowli komórkowych oraz 1,5 ml pożywki do hodowli komórkowych w każdym dołku. Podgrzej płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
3. Pobieranie zarodków E10.5 i przygotowanie plastrów
UWAGA: Wszystkie kroki od tego momentu powinny być wykonane tak szybko, jak to możliwe. Trzymaj zarodki na lodzie przez cały czas.
- Poddać eutanazji ciężarną matkę (E10.5) w komorze CO2 . Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy.
- Spryskaj brzuch 70% etanolem. Rozetnij brzuch nożyczkami, usuń macicę i umieść ją na szalce Petriego z lodowatym HBSS, aby szybko zmyć krew. Przenieś umytą macicę do drugiego Petriego wypełnionego lodowatym naczyniem HBSS.
- Pod lunetą sekcyjną usuń zarodki z rogu macicy i poszczególnych worków owodniowych. Umieścić zarodki na spodniej stronie pokrywy płytki 12-dołkowej. Trzymaj na lodzie.
- Pod lunetą sekcyjną użyj bibuły filtracyjnej, aby usunąć płyn otaczający każdy zarodek.
nuta: Zarodki przykleją się do bibuły filtracyjnej po dotknięciu.
- Osadź zarodki w agarozie. Wlej roztopioną agarozę na każdy zarodek, aby go przykryć. Trzymaj na lodzie. Gdy tylko agaroza stwardnieje, odwróć każdy zarodek i wlej dodatkową agarozę na drugą stronę. Trzymaj na lodzie.
- Za pomocą fluorescencyjnej lunety preparacyjnej przytnij agarozę wokół każdego zarodka, aby była prawidłowo zorientowana po przyklejeniu do etapu wibratomu. Jądro okoruchowe i wczesny wyrostek aksonów są fluorescencyjne. Ustaw zarodek tak, aby jądro, wyrastające aksony i oko tworzyły linię, a agarozę przyciąć żyletką przyciętą równolegle do tej linii (grzbietowo do zarodka, patrz ryc. 1A).
nuta: Będzie to strona przyklejona do etapu wibratomu (zarodek zostanie umieszczony na plecach, głowa najbliżej ostrza wibratomu). Linia między jądrem okoruchowym a okiem powinna być równoległa do ostrza wibratomu.
- Napełnij komorę wibratomu lodowatym buforem do plastrów. Przyklej zarodek do etapu wibratomu, tak aby ostrze było równoległe do jądra okoruchowego i oczu. Gdy superglue wyschnie, zanurz etap wibratomu tak, aby zarodek był zorientowany odwrotnie niż ostrze.
- Pokrój plastry 400-450 μm. Zebrać każdy plasterek za pomocą sterylnej pipety transferowej. Umieść w buforze do krojenia na zimno.
- Pod lunetą sekcyjną wybierz wycinek zawierający jądra okoruchowe i oczy. Za pomocą sterylnej pipety transferowej umieścić ją na wkładce do hodowli komórkowej w płytce 6-dołkowej. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Alternatywnie, niech jedna osoba kroi, a druga układa plasterki. Zminimalizuj czas między krojeniem a umieszczeniem w inkubatorze.
nuta: Plastry powinny być zorientowane w taki sposób, aby maksymalna fluorescencja emitowana z jąder i aksonów była najbliższa obiektywowi mikroskopu obrazowego. W mikroskopie odwróconym plastry należy umieścić na membranie z jądrami i aksonami najbliżej obiektywu pod płytką.
- Usuń pozostałą agarozę ze stadium wibratomu, przyklej następny zarodek do etapu i powtarzaj kroki 3.7-3.9, aż wszystkie zarodki zostaną pokrojone i pokryte.
- Dodaj wybrany inhibitor lub rekombinowaną cząsteczkę do pożywki w każdym dołku, aby utworzyć krzywą dawka-odpowiedź. Rozcieńczyć w odpowiednim rozpuszczalniku.
nuta: W przypadku stosowania dimetylosulfotlenku (DMSO) należy używać wyłącznie DMSO klasy kultur tkankowych. Alternatywnie, kulki uwalniające białko można umieścić w określonych miejscach na plastrze.
- Umieścić pod mikroskopem w komorze o temperaturze 37 °C i 5%CO2. Ustaw mikroskop tak, aby wykonywał zdjęcia kontrastu fazowego i fluorescencyjne każdego wycinka co 30 minut (lub częściej, jeśli jest to pożądane). Plastry można przechowywać przez 48-72 godziny.
