Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Zbieraj DRG odcinka lędźwiowego od szczurów doświadczalnych
- Użyj 2- do 3-tygodniowych szczurów Sprague-Dawley (SD) do zbierania DRG w odcinku lędźwiowym.
UWAGA: Neurony DRG pobrane od szczurów w wieku powyżej 4 tygodni nie rosną dobrze w warunkach hodowli opisanych w niniejszym dokumencie.
- Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie.
- Znieczulić szczura mieszaniną tiletaminy i zolazepamu w stosunku 1:1 (20 mg/kg; wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP)) i poczekać, aż zwierzę nie wykaże reakcji na wycofanie stopy w teście szczypania palców.
nuta: W tym protokole można z powodzeniem stosować różne strategie znieczulenia.
- Złóż szczura w ofierze przez ścięcie za pomocą komercyjnej gilotyny.
- Użyj gilotyny, aby odizolować tułów szczura między kończyną przednią a kością udową. Na rysunku 1A przedstawiono schemat obszaru, który ma zostać zebrany.
nuta: Linia cięcia ogonowego powinna być tylko rostralna do kości udowej. DRG lędźwiowy L6 zostanie wycięty, jeśli miejsce cięcia znajduje się zbyt wysoko w kręgosłupie.
- Przeciąć wzdłuż mostka i usunąć wszystkie narządy/tkanki nożyczkami preparacyjnymi (ryc. 2A-a).
- Przetnij wzdłuż boku tułowia, aby zebrać grzbietową część szczura i usunąć skórę. Na rycinie 1B znajduje się zdjęcie rozciętego pnia grzbietowego.
- Przygotuj tkankę na lodzie przed pobraniem DRG. Oczyść futro i krew z rękawiczek i wysterylizuj je 75% etanolem przed przejściem do następnego kroku.
- Usuń mięśnie pokrywające odcinek lędźwiowy kręgosłupa. Najpierw wykonaj dwa nacięcia wzdłuż boków kręgosłupa (po lewej i prawej stronie) i jedno cięcie boczne, aby zaznaczyć rostralny zasięg kręgosłupa lędźwiowego. Następnie usuń mięśnie grzbietowe kręgosłupa za pomocą kleszczy do cięcia kości (ryc. 2A-b).
- Usuń grzbietową część kręgów za pomocą kleszczy do cięcia kości i odsłoń rdzeń kręgowy.
- Usuń rdzeń kręgowy za pomocą nożyczek preparacyjnych (ryc. 2A-c) i kleszczy (ryc. 2A-d).
- Zidentyfikuj DRG odcinka lędźwiowego, licząc kręgi od ostatniego żebra (kręg piersiowy 13). Rysunek 1C przedstawia schemat pozycji kręgów.
- Zebrać obustronny DRG odcinka lędźwiowego (L1-L6) za pomocą mikronożyczek (ryc. 2A-f) do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm z 2 ml lodowatej pożywki bez surowicy. Usuń włókna neuronalne (jak pokazano na rysunku 1C) z połączenia DRG, a następnie przenieś je do naczynia hodowlanego, aby poprawić czystość kultur.
nuta: Zebrany DRG można przechowywać w podłożu na lodzie przez około 1 godzinę. Tymczasem wiele szczurów można poddać eutanazji, aby stworzyć większą pulę DRG.
2. Pierwotna kultura DRG z drewna szczurzego
UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym.
- Przygotować pożywkę hodowlaną zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 mM pirogronianu sodu i 1x penicylinę/streptomycynę w 1x DMEM-F12.
- Pokryj 24-dołkową płytkę poddaną działaniu hodowli komórkowej 200 μg/ml poli-L-lizyny przez 2 godziny, a następnie przemyj wysterylizowaną wodą.
- Przed użyciem należy wstępnie inkubować szalkę hodowlaną z 1 ml pożywki hodowlanej w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.
- Przenieść naczynie 35 mm zawierające DRG do okapu laminarnego i umyć DRG 3-krotnym roztworem bez surowicy za pomocą pipety.
nuta: Zewnętrzną część naczynia należy oczyścić 75% etanolem przed włożeniem do okapu. Czasza o średnicy 35 mm może zawierać DRG od wielu szczurów (będzie to zależało od wymagań projektu eksperymentalnego).
- Przenieś DRG (od pojedynczego szczura lub połączonego z wieloma szczurami) do nowej płytki hodowlanej o średnicy 35 mm, która zawiera 2 ml kolagenazy typu IA (1 mg/ml w podłożu bez surowicy) za pomocą sterylnej pęsety (ryc. 2A-e).
nuta: Roztwór kolagenazy należy wysterylizować, przepuszczając go przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
- Trawić DRG w roztworze kolagenazy w inkubatorze CO 2 o temperaturze 37 °Cprzez 30 minut.
- Usuń roztwór kolagenazy i umyj DRG 3 razy w 2 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS).
nuta: Mogą istnieć resztki włókien lub tkanek, które przedostają się z DRG do roztworu. Usuń je pipetą z roztworem myjącym.
- Dodać 2 ml wstępnie podgrzanej 0,05% trypsyny-EDTA do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego DRG i trawić DRG w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C przez 30 minut.
- Przenieść 2 ml roztworu zawierającego DRG do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą szklanej pipety.
nuta: DRG może przykleić się do szklanej pipety, dlatego ten krok należy wykonywać ostrożnie. Strat DRG można uniknąć, trzymając roztwór zawierający DRG w zwężającym się końcu szklanej pipety (około 0,5 ml) i przenosząc roztwór do probówki wirówkowej powoli, ale bez przerwy.
- Odwirować roztwór o stężeniu 290 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dodać kolejne 2 ml pożywki pozbawionej surowicy w celu ponownego zawieszenia DRG.
- Powtórz krok 2.10 2 razy, ale ostatnim razem zmień pożywkę bez surowicy na wstępnie podgrzaną pożywkę hodowlaną.
- Ręcznie rozcierać DRG około 60 razy za pomocą polerowanej płomieniowo pipety Pasteura (długość 230 mm i średnica wewnętrzna główki końcówki 1 mm). Na rysunku 2B znajduje się zdjęcie porównujące otwór pipety Pasteura polerowanej płomieniowo z pipetą niepolerowaną.
nuta: Średnica wewnętrzna polerowanej płomieniowo pipety Pasteura jest o około 10% mniejsza niż pipety kontrolnej, a wnętrze stożkowej końcówki powinno być gładsze. Uważaj, aby nie tworzyć bąbelków podczas rozcierania komórek.
- Wyjąć naczynie pokryte poli-L-lizyną z inkubatora CO2 . Odessać inkubowaną pożywkę hodowlaną z szalki i wysiać zdysocjowane komórki na powlekane naczynie.
- Wysiewaj komórki DRG od jednego szczura (dwustronna kolekcja od L1-L6, dla całkowitej liczby 12 DRG) do czterech dołków 24-dołkowej płytki; w jednym dołku 24-dołkowej płytki znajduje się około 5 x 104 komórek.
nuta: Ta gęstość jest odpowiednia do barwienia immunologicznego. W przypadku ekstrakcji Western blot lub RNA, wysiewaj komórki DRG od jednego szczura (obustronne L1-L6) do jednego dołka na 6-dołkowej płytce.
- Następnego dnia zastąp pożywkę hodowlaną dodatkiem 10 μM cytarabiny (Ara-C) i 100 ng/ml NGF, a następnie odświeżaj pożywkę co dwa dni.
nuta: Za pomocą tego protokołu można również wyhodować DRG klatki piersiowej, jeśli zostały one pobrane z odcinka piersiowego kręgosłupa.
