Wykorzystanie pułapki optycznej do badania interakcji gospodarz-patogen do dynamicznego obrazowania żywych komórek

Summary

Opisano metodę indywidualnego wybierania, manipulowania i obrazowania żywych patogenów za pomocą pułapki optycznej sprzężonej z mikroskopem z wirującym dyskiem. Pułapka optyczna zapewnia przestrzenną i czasową kontrolę organizmów i umieszcza je w sąsiedztwie komórek gospodarza. Mikroskopia fluorescencyjna rejestruje dynamiczne interakcje międzykomórkowe przy minimalnych zakłóceniach komórek.

Abstract

Dynamiczne obrazowanie żywych komórek pozwala na bezpośrednią wizualizację interakcji w czasie rzeczywistym między komórkami układu odpornościowego^{1, 2}; jednak brak przestrzennej i czasowej kontroli między komórką fagocytarną a mikrobem utrudnił bezpośrednie obserwacje początkowych interakcji odpowiedzi gospodarza na patogeny. Historycznie rzecz biorąc, zdarzenia kontaktu międzykomórkowego, takie jak fagocytoza³, były obrazowane poprzez mieszanie dwóch typów komórek, a następnie ciągłe skanowanie pola widzenia w celu znalezienia nieoczekiwanych kontaktów międzykomórkowych na odpowiednim etapie interakcji. Stochastyczna natura tych zdarzeń sprawia, że proces ten jest żmudny i trudno jest zaobserwować wczesne lub przelotne zdarzenia w kontakcie komórka-komórka za pomocą tego podejścia. Ta metoda wymaga znalezienia par komórek, które są na skraju kontaktu i obserwowania ich, dopóki nie skonsumują swojego kontaktu lub nie. Aby zaradzić tym ograniczeniom, stosujemy pułapkowanie optyczne jako nieinwazyjną, nieniszczącą, ale szybką i skuteczną metodę pozycjonowania komórek w hodowli.

Pułapki optyczne, czyli pęsety optyczne, są coraz częściej wykorzystywane w badaniach biologicznych do przechwytywania i fizycznego manipulowania komórkami i innymi cząstkami o rozmiarach mikronowych w trzech wymiarach⁴. Ciśnienie promieniowania zostało po raz pierwszy zaobserwowane i zastosowane w systemach pęsety optycznej w 1970 roku^{, 5, 6}, a po raz pierwszy użyto go do kontroli próbek biologicznych w 1987^roku. Od tego czasu pęsety optyczne dojrzały do tego, aby stać się technologią do badania różnych zjawisk biologicznych^8-13.

Opisujemy metodę¹⁴, która rozwija obrazowanie żywych komórek poprzez integrację pułapki optycznej z mikroskopią konfokalną z wirującym dyskiem z kontrolą temperatury i wilgotności, aby zapewnić znakomitą przestrzenną i czasową kontrolę organizmów chorobotwórczych w środowisku fizjologicznym, aby ułatwić interakcje z komórkami gospodarza, zgodnie z ustaleniami operatora. Żywe, chorobotwórcze organizmy, takie jak Candida albicans i Aspergillus fumigatus, które mogą powodować potencjalnie śmiertelne, inwazyjne infekcje u osób z obniżoną odpornością^{15, 16} (np. pacjentów z AIDS, chemioterapią i przeszczepami narządów), zostały optycznie uwięzione przy użyciu nieniszczących intensywności lasera i przemieszczone w sąsiedztwie makrofagów, które mogą fagocytozę patogenu. Filmy o wysokiej rozdzielczości, świetle przechodzącym i fluorescencji umożliwiły obserwację wczesnych zdarzeń fagocytozy w żywych komórkach. Aby wykazać szerokie zastosowanie w immunologii, pierwotne limfocyty T zostały również uwięzione i zmanipulowane w celu utworzenia synaps z mikrosferami pokrytymi anty-CD3 in vivo, a także uzyskano obrazowanie poklatkowe tworzenia synaps. Dzięki opracowaniu metody precyzyjnej kontroli przestrzennej żywych patogenów w odniesieniu do komórek odpornościowych, interakcje komórkowe mogą być rejestrowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy minimalnych zakłóceniach w komórkach i mogą dostarczyć potężnych informacji na temat wczesnych reakcji odporności wrodzonej i nabytej.

Protocol

1. Warunki hodowli patogenów do pułapki optycznej

1. Hodować A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) na półstałym podłożu agarowym zawierającym SBD (dekstroza Sabouraud) w temperaturze 30°C przez 3 dni.
2. Hodować C. albicans (SC5314) w płynnej kulturze YPD (Yeast-Peptone Dextrose) zawierającej 100 μg/ml ampicyliny przez noc w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 30°C.

2. Przygotowanie patogenów do znakowania fluorescencyjnego

1. Zbierz żądaną ilość patogenów i przenieś do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml.
2. Dodać 300 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do probówki reakcyjnej.
3. Sonikuj mieszaninę przez 30 sekund.
4. Wirować z prędkością 4000 obr./min przez 1 minutę.
5. Odessać supernatant, pozostawiając osad w nienaruszonym stanie.
6. Powtórzyć (2.4) i (2.5) jeszcze dwa razy.
7. Zawiesić w 500 μl PBS.

3. Znakowanie patogenów barwnikiem fluorescencyjnym

1. Rozpuścić 1 mg interesującego barwnika (np. Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647) w 100 μl dimetyloformamidu (DMF) (stężenie 10 mg/ml).
2. Dodać 3 μl mieszaniny barwników do probówek reakcyjnych zawierających przemyte patogeny.
3. Obracać lub wstrząsać próbką w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.
4. Przemyć próbkę PBS 3X, wirując z prędkością 4000 obr./min przez 1 minutę.
5. Zawiesić w 300 μl PBS.

4. Pobieranie limfocytów T z krwi pełnej

1. Uzyskaj krew pełną (świeżą).
2. Ciepła krew, PBS + 2% płodowa surowica bydlęca (FBS) i histopakująca do temperatury pokojowej.
3. Dodaj RosetteSep Human CD4+ Koktajl wzbogacający limfocyty T w 50 μl/ml krwi pełnej.
4. Obrócić próbkę i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
5. Rozcieńczyć próbkę równą objętością PBS + 2% FBS i delikatnie wymieszać.
6. Rozcieńczoną próbkę nakłada się warstwami na histopak, minimalizując mieszanie
7. Wirować przez 20 minut przy 1200 x g w temperaturze pokojowej przy wyłączonym hamulcu.
8. Usuń wzbogacone komórki.
9. Przemyj wzbogacone komórki 2x roztworem PBS + 2% FBS.
10. Lizować czerwone krwinki przez 2 minuty za pomocą buforu do lizy czerwonych krwinek
11. Dodaj 10 ml PBS + 2% FBS i odwiruj lizowane krwinki czerwone z prędkością 1500 obr./min przez 5 minut
12. Odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu
13. Zawiesić w pożywce IMDM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej

5. Przygotowanie makrofagów RAW 264.7 do szkiełek komorowych

1. Przygotuj DMEM (zmodyfikowane podłoże Eagle's Medium firmy Dulbecco) tak, aby zawierało 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy.
2. Ciepłe podłoże, trypsyna i PBS w ciepłej kąpieli do 37°C.
3. Płyta myjąca 2x z PBS
4. Odsysaj PBS między każdym praniem.
5. Dodaj 5 ml trypsyny na płytkę, aby pokryła powierzchnię (dla 10 cm płytki do hodowli tkankowej).
6. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37°C.
7. Delikatnie uderz w bok płytki, aby oderwać komórki od powierzchni płytki. Uważaj, aby nie rozpryskiwać trypsyny na zewnątrz talerza.
8. Dodaj 5 ml lub równoważną ilość pożywki do trypsyny.
9. Odessać mieszaninę do probówki reakcyjnej.
10. Wirować przy 1000 x g przez 3 minuty.
11. Zassać pożywkę, uważając, aby nie naruszyć osadu.
12. Zawiesić w 10 ml pożywki.
13. Dodać 400 μl pożywki do każdej komory szkiełka komorowego.
14. Dodać 5 μl zawiesiny komórkowej do każdej komory.
15. Uprawiać przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C z 5% CO_{2 .}

6. Dodawanie patogenów do próbki

1. Odpipetować 5-10 μl znakowanych patogenów będących przedmiotem zainteresowania (z kroków 1-3) do komory.
2. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół, uważając, aby nie dotknąć dna komory, aby naruszyć przylegające makrofagi.

7. Ładowanie próbki do mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem (na wideo, skanowanie przez komponenty)

1. Włącz wszystkie elementy mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem.
2. Dopasuj mikroskop do obrazowania DIC.
3. Wyjąć szkiełko komory z inkubatora.
4. Włóż suwak komory do specjalistycznego etapu.
5. Zdejmij górną część szkiełka komory (niezbędne do obrazowania DIC).

8. Przygotowanie do pułapki optycznej (na filmie, skanowanie komponentów i sposób ich integracji z mikroskopem)

1. Włącz migawkę dla pułapki optycznej.
2. Włącz laser na podczerwień.
3. Otwórz migawkę (na laserze) do pułapki optycznej.
4. Upewnij się, że migawka przed laserem IR jest zamknięta, sprawdzając za pomocą karty IR.

9. Selekcja i manipulacja patogenem za pomocą pułapki optycznej

1. Skoncentruj się na makrofagach na przylegającym szkiełku.
2. Znajdź patogeny swobodnie zmieniające się w roztworze sąsiadującym z makrofagami.
3. Przesuń etap tak, aby patogen znajdował się w pobliżu pułapki.
4. Otwórz migawkę i włącz pułapkę.
5. Przenieś próbkę, aby doprowadzić makrofagi do kontaktu ze stacjonarnym uwięzionym patogenem.
6. Obraz za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem, w trybie DIC, fluorescencji lub kombinacji obu. Zazwyczaj pułapkowanie odbywa się w DIC, a obrazowanie w czasie rzeczywistym odbywa się za pomocą fluorescencji.

10. Reprezentatywne wyniki:

Aby sprawować pełną kontrolę przestrzenną i czasową nad patogenami i koralikami w środowisku in vivo i in vitro, zaprojektowaliśmy specjalnie skonstruowane urządzenie do łapania zintegrowane z mikroskopem konfokalnym z wirującym dyskiem (schemat pokazany na Rys. 1). Przy pełnej mocy laser dostarczał 350 mW mocy, a po sprzężeniu światła z różnymi elementami optycznymi w aparacie pułapki optycznej, do uformowania pułapki w komorze wykorzystano ̃80 mW mocy na obiektywie TIRF, mierzoną miernikiem mocy.

Aby ustawić obiekt w komorze względem uwięzionego obiektu, scena była przesuwana, podczas gdy uwięziony obiekt był nieruchomy za pomocą lasera pułapkowego. Stopień był poruszany z wystarczająco małą prędkością, tak aby siła oporu uwięzionej cząstki nie przekraczała maksymalnej siły wychwytywania.

Oddzielne populacje C. albicans (typowy rozmiar - ̃5 μm) zostały oznaczone każdym z trzech kolorów (AF488, AF568 i AF647, odpowiadających odpowiednio zielonemu, niebieskiemu i czerwonemu na rysunku), aby zilustrować obrazowanie za pomocą wielu kanałów fluorescencyjnych, jednocześnie optycznie zatrzymując patogen. Pojedynczy C. albicans został uwięziony i przemieszczał się w kwadratowy wzór przez skupisko innych drożdży, jak wskazują szare strzałki, demonstrując zdolność do wychwytywania i manipulowania specyficzną lokalizacją pojedynczego patogenu wybranego przez operatora nawet w zatłoczonym środowisku (ryc. 2A).

Aby jeszcze bardziej zilustrować elastyczność tego systemu w celu wychwytywania różnych morfologii kształtów wykazywanych przez organizmy chorobotwórcze, pęseta optyczna była również w stanie zatrzymać i umieścić cząstkę C. albicans za pomocą pseudostrzępek. C. albicans oznaczony AF647 (czerwony) przemieszczono wzdłuż trajektorii wyznaczonej białą strzałką i umieszczono obok fluorescencyjnych komórek GFP-LC3-RAW (ryc. 2B). Drożdżowa część C. albicans została uwięziona, gdy pseudostrzępki ciągnęły się za sobą.

Umieściliśmy również Aspergillus fumigatus obok komórki makrofagów myszy RAW, aby przeanalizować bezwzględne ramy czasowe fagocytozy z tą konkretną linią komórkową i patogenem (Ryc. 3A). Gdy patogen wejdzie w kontakt z komórką, pułapka jest wyłączana, a obrazowanie poklatkowe jest wykorzystywane do obserwacji kolejnych zdarzeń komórkowych (ryc. 3B). Pułapka optyczna została również wykorzystana do wychwycenia pierwotnych limfocytów T wyizolowanych z krwi i skierowanych w sąsiedztwo kulek pokrytych przeciwciałem anty-CD3, aby limfocyt T utworzył immunologiczną synapsę z kulką (ryc. 4), pokazując dodatkową wszechstronność w bezpośrednim wychwytywaniu i manipulowaniu komórkami odpornościowymi.

Rysunek 1. Przegląd i schemat zestawu połączonego mikroskopu konfokalnego z pułapką optyczną i wirującym dyskiem. Układ przyrządów przedstawiający wiązkę pułapkującą (fioletowy), ścieżkę oświetlenia do obrazowania w jasnym polu (pomarańczowy), wiązkę wzbudzenia fluorescencji (czerwoną), emisję fluorescencji (zieloną), kamerę urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym (CCD), kamerę ze sprzężeniem ładunku zwielokrotnionym elektronami (EM-CCD), zwierciadła dichroiczne (D1 i D2), lustra (M1 i M2) oraz soczewki (L1, L2, L3, L4). Wszystkie inne elementy systemu mikroskopu pułapkowo-konfokalnego są oznaczone na rysunku.

Rysunek 2. (A) Obrazy fluorescencyjne uwięzionych i zmanipulowanych C. albicans. Uwięziony fluorescencyjnie znakowany (Alexa Fluor 488 (AF488), niebieski) organizm na polu innych znakowanych fluorescencyjnie C. albicans (AF568, zielony i AF647, czerwony). Stolik jest przesuwany wokół uwięzionej, niebieskiej cząstki CA, jak wskazują szare strzałki. (B) Uwięziona pseudo-strzępkowa forma C. albicans obok komórki GFP-LC3 RAW. Znakowana fluorescencyjnie pseudohyfalna forma CA (czerwona, AF647) optycznie uwięziona i przeniesiona w sąsiedztwie makrofagów RAW z ekspresją GFP-LC3. Organizm CA przemieszcza się po trajektorii wskazanej białą strzałką.

Rysunek 3. Wychwytywanie i umieszczanie A. fumigatus obok fagocytarnej komórki RAW. (A) Obrazy w jasnym polu uwięzionego A. fumigatus, jak wskazuje biała strzałka, poruszają się i ustawiają wzdłuż ścieżki wskazanej przez czerwoną strzałkę. Uwięziony patogen jest nieco nieostry, ponieważ pułapka wypycha organizm nieco powyżej płaszczyzny ogniskowej. A. fumigatus jest przesuwany, dopóki nie zostanie umieszczony obok żądanej komórki RAW. (B) Obrazowanie fluorescencyjne fagocytozy A. fumigatus za pomocą komórki RAW. Po umieszczeniu uwięzionego patogenu obok komórki RAW aktywowany jest proces fagocytozy. Po 30 s błona komórki RAW zaczyna się zmieniać i tworzyć miseczkę wokół cząsteczki. Po 60 s kubek jest w pełni uformowany. Od 90 do 150 s A. fumigatus jest pochłonięty, a po 180 s cząstka jest w pełni zinternalizowana

Rysunek 4. Pułapkowanie pierwotnej limfocytu T w celu utworzenia synapsy z kulkami pokrytymi anty-CD3. Obrazy DIC pierwotnej limfocytu T przesuniętego przez pułapkę optyczną do pozycji obok kulki pokrytej przeciwciałem anty-CD3. Komórka tworzy następnie synapsę immunologiczną, której nie można łatwo dostrzec na obrazach.

Discussion

W tej pracy wykorzystujemy pułapkę optyczną do wychwytywania patogenów o wymiarach od 3 μm do 5 μm. Chociaż patogeny będące przedmiotem zainteresowania naszego laboratorium zazwyczaj mają takie wymiary, opisany tutaj system pęsety optycznej jest elastyczny, aby wyłapywać szeroki zakres rozmiarów. Rzeczywiście, pułapki optyczne były używane do wychwytywania cząstek o średnicy około 10 μm, od pojedynczych atomów po komórki. Dodatkowo ten optyczny system pułapkowania był w stanie wychwycić cząstki o różnych kształtach: k...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A. fumigatus			Albino szczep, B-5233/RGD12-8, dar od K.J. Kwon-Chunga, NIH
C. albicans			SSY50-B mutant, dar od Eleftheriosa Mylonakisa, MGH; Szczep SC5314, prezent od Geralda Finka, Whitehead Institute
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A20000
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A20006
dimetyloformamid	Sigma-Aldrich	D4551
Świeża krew			Prezent od R.J.W. Heath, MGH, HMS
Mikroskop odwrócony Nikon	Nikon		Laser pułapkujący Ti-E
, ChromaLase	Blue Sky Research	CLAS-106-STF02-02
Laser wzbudzenia fluorescencyjnego	Coherent Inc.		Model Innova 70C
Płytki stykowe do zalewkowania komponentów	Thorlabs Inc.	MB1224, MB1218
Stół optyczny z powietrzem	Technical Manufacturing Corp.
Elektroniczna migawka ze sterowaniem pedałem	Uniblitz		Zakupiony od Vincent Associates, Rochester, NY
Światłowód jednomodowy	Oz Optics	PMJ-3S3S-1064-6
Pozycjoner	światłowodowy Thorlabs Inc.	PAF-X-5-C
Kolimator światłowodowy	Oz Optyka	HPUCO-23-1064-P-25AC
Soczewki do teleskopu	Thorlabs Inc.	AC254-150-B	Ogniskowa 150 mm
Etapy translacji (x, y, z)	Newport Corp.	M-461-XYZ
IR	Chroma Technology Corp.	ET750-sp-2p8
Obiektyw obiektywowy (100X)	Nikon Instruments		NA = 1.49, zanurzenie w olejku, obiektyw TIRF
Głowica konfokalna	Yokogawa	CSU-XI
Polaryzator	Nikon Instruments	MEN51941
pryzmatem Wollaston	Nikon Instruments	MBH76190
Aparat EM-CCD	Hamamatsu Corp.	Kamera CCD C9100-13
(ORCA ER)	Hamamatsu Corp.	C4742-80-12AG
Koło filtrowe	Ludl	99A353
Koło filtrowe	Sutter Instrument Co.	LB10-NWE
Szkło nakrywkowe komorowe	Lab-Tek	155409
Dynabeads	Invitrogen	111-51D	Pokryte anty-CD3
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)	Invitrogen	10313
Penicylina/streptomycyna	Invitrogen	15140-122
L-glutamina	Invitrogen	25030-081
Płodowa surowica bydlęca (Hyklon)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30071.03