Opisano metodę indywidualnego wyboru, manipulowania i obrazowania żywych patogenów przy użyciu pułapki optycznej sprzężonej z mikroskopem dyskowym (spinning disk). Pułapka optyczna zapewnia przestrzenną i czasową kontrolę nad organizmami i pozwala na umieszczenie ich w bezpośrednim sąsiedztwie komórek gospodarza. Mikroskopia fluorescencyjna pozwala na rejestrację dynamicznych interakcji międzykomórkowych przy minimalnym zaburzeniu stanu komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie pułapki optycznej do badania oddziaływań gospodarz-patogen w dynamicznym obrazowaniu żywych komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dynamiczne obrazowanie żywych komórek umożliwia bezpośrednią wizualizację interakcji w czasie rzeczywistym między komórkami układu odpornościowego1, 2; jednak brak kontroli przestrzennej i czasowej między komórką fagocytarną a drobnoustrojem utrudnia prowadzenie ukierunkowanych obserwacji początkowych interakcji odpowiedzi gospodarza na patogeny. Historycznie zdarzenia kontaktu międzykomórkowego, takie jak fagocytoza3, były obrazowane poprzez mieszanie dwóch typów komórek, a następnie ciągłe skanowanie pola widzenia w celu przypadkowego znalezienia kontaktów międzykomórkowych na odpowiednim etapie interakcji. Stochastyczny charakter tych zdarzeń sprawia, że proces ten jest żmudny, a obserwacja wczesnych lub przelotnych zdarzeń w kontakcie komórka-komórka za pomocą tej metody jest trudna. Metoda ta wymaga odnalezienia par komórek znajdujących się na granicy kontaktu i obserwowania ich do momentu, gdy kontakt zostanie sfinalizowany lub nie dojdzie do niego. Aby wyeliminować te ograniczenia, wykorzystujemy pułapkowanie optyczne jako nieinwazyjną, niedestrukcyjną, a jednocześnie szybką i skuteczną metodę pozycjonowania komórek w kulturze.
Pułapki optyczne, czyli pęsety optyczne, są coraz częściej wykorzystywane w badaniach biologicznych do wychwytywania i fizycznej manipulacji komórkami oraz innymi cząstkami o rozmiarach mikronowych w trzech wymiarach4. Ciśnienie promieniowania zostało po raz pierwszy zaobserwowane i zastosowane w systemach pęset optycznych w 1970 roku5, 6, a po raz pierwszy użyto go do kontrolowania próbek biologicznych w 1987 roku7. Od tego czasu pęsety optyczne rozwinęły się w technologię pozwalającą na badanie różnorodnych zjawisk biologicznych8-13.
Opisujemy metodę14, która usprawnia obrazowanie żywych komórek poprzez zintegrowanie pułapki optycznej z konfokalną mikroskopią dysku wirującego oraz kontrolą temperatury i wilgotności, co zapewnia wyjątkową kontrolę przestrzenną i czasową nad organizmami patogennymi w środowisku fizjologicznym, ułatwiając interakcje z komórkami gospodarza zgodnie z decyzją operatora. Żywe organizmy patogenne, takie jak Candida albicans i Aspergillus fumigatus, które mogą powodować potencjalnie śmiertelne, inwazyjne infekcje u osób z niedoborem odporności15, 16 (np. pacjentów z AIDS, poddawanych chemioterapii lub przeszczepom organów), były chwytane optycznie przy użyciu niedestrukcyjnych intensywności laserowych i przemieszczane w sąsiedztwo makrofagów, które mogą fagocytować patogen. Filmy o wysokiej rozdzielczości, wykonane w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym, potwierdziły możliwość obserwacji wczesnych zdarzeń fagocytozy w żywych komórkach. Aby zademonstrować szerokie zastosowanie w immunologii, chwytać i manipulować próbowano również pierwotnymi limfocytami T w celu tworzenia synaps z mikrosferami powleczonymi anty-CD3 in vivo, uzyskując obrazowanie poklatkowe procesu formowania synaps. Dzięki udostępnieniu metody precyzyjnej kontroli przestrzennej żywych patogenów względem komórek odpornościowych, interakcje komórkowe mogą być rejestrowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy minimalnych zaburzeniach komórek, co pozwala uzyskać cenne informacje na temat wczesnych odpowiedzi odporności wrodzonej i nabytej.
Protokół
1. Warunki hodowli patogenów do pułapkowania optycznego
- Hodować A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) na półpłynnej pożywce agarowej zawierającej SBD (Sabouraud dextrose) w temperaturze 30°C przez 3 dni.
- Hodować C. albicans (SC5314) w płynnej kulturze YPD (Yeast-Peptone Dextrose) zawierającej 100 μg/mL ampicyliny przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30°C.
2. Przygotowanie patogenów do znakowania fluorescencyjnego
- Zebrać pożądaną ilość patogenów i przenieść do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 mL.
- Do probówki reakcyjnej dodać 300 μL fosforanu soli buforowanej (PBS).
- Mieszaninę poddać sonikacji przez 30 sekund.
- Wirować z prędkością 4000 rpm przez 1 minutę.
- Odssać nadsącz, nie naruszając osadu.
- Powtórzyć kroki (2.4) i (2.5) jeszcze dwa razy.
- Resuspendować w 500μL PBS.
3. Znakowanie patogenów barwnikiem fluorescencyjnym
- Rozpuścić 1 mg wybranego barwnika (np. Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647) w 100 μL dimetyloformamidu (DMF) (stężenie 10 mg/mL).
- Dodać 3 μL mieszaniny barwnika do probówek reakcyjnych zawierających przemyte patogeny.
- Próbkę rotować lub wstrząsać w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.
- Przemyć próbkę PBS 3X, wirując z prędkością 4000 rpm przez 1 minutę.
- Resuspendować w 300 μL PBS.
4. Izolowanie limfocytów T z krwi pełnej
- Pobrać krew pełną (świeżą).
- Doprowadzić krew, PBS + 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz histopaque do temperatury pokojowej.
- Dodać koktajl do wzbogacania limfocytów T CD4+ RosetteSep Human w ilości 50 μL/mL krwi pełnej.
- Obracać próbkę i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Rozcieńczyć próbkę równą objętością PBS + 2% FBS i delikatnie wymieszać.
- Nanieść rozcieńczoną próbkę na wierzch histopaque, minimalizując mieszanie.
- Wirować przez 20 minut przy 1200 x g w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamulcem.
- zebrać wzbogacone komórki.
- Przemyć wzbogacone komórki 2x roztworem PBS + 2% FBS.
- Lizować erytrocyty przez 2 minuty przy użyciu buforu do lizy erytrocytów.
- Dodać 10 mL PBS + 2% FBS i wirować zlizowane erytrocyty przy 1500 rpm przez 5 minut.
- Odssać nadosad, uważając, aby nie poruszyć osadu.
- Resuspendować w pożywce IMDM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej.
5. Przygotowanie makrofagów RAW 264.7 w szkiełkach komorowych
- Przygotować DMEM (pożywka Eagle'a modyfikowana przez Dulbecco) zawierającą 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny oraz 1% L-glutaminy.
- Podgrzać pożywkę, trypsynę i PBS w kąpieli wodnej do 37°C.
- Przemyć płytkę 2x roztworem PBS.
- Odsysać PBS po każdym przemyciu.
- Dodać 5 mL trypsyny na płytkę, aby pokryć powierzchnię (dla płytki hodowlanej o średnicy 10 cm).
- Inkubować przez 5 min w temperaturze 37°C.
- Delikatnie opukać bok płytki, aby odłączyć komórki od jej powierzchni. Należy uważać, aby nie rozbryzgać trypsyny poza płytkę.
- Dodać 5 mL lub równoważną ilość pożywki do trypsyny.
- Odsysać mieszaninę do probówki reakcyjnej.
- Wirować przy 1000 x g przez 3 minuty.
- Odsysać pożywkę, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
- Resuspendować w 10 mL pożywki.
- Dodać 400 μL pożywki do każdej komory szkiełka wielokomorowego.
- Dodać 5 μL zawiesiny komórkowej do każdej komory.
- Hodować przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C przy 5% CO2.
6. Dodanie patogenów do próbki
- Pipetować 5-10 μL oznakowanych patogenów (z kroków 1-3) do komory.
- Wymieszać dokładnie, pipetując w górę i w dół, uważając, aby nie dotknąć dna komory i nie zakłócić przywierdziałych makrofagów.
7. Nakładanie próbki na konfokalny mikroskop dyskowy (w filmie: przegląd komponentów)
- Włącz wszystkie komponenty konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym.
- Ustaw mikroskop do obrazowania DIC.
- Wyjmij szkiełko z komorą z inkubatora.
- Włóż szkiełko z komorą do specjalistycznego stolika.
- Zdejmij górną część szkiełka z komorą (niezbędne do obrazowania DIC).
8. Przygotowanie do pułapkowania optycznego (w filmie przejrzyj komponenty oraz sposób ich integracji z mikroskopem)
- Włącz migawkę pułapki optycznej.
- Włącz laser podczerwony (IR).
- Otwórz migawkę (na laserze) prowadzącą do pułapki optycznej.
- Potwierdź, że migawka przed laserem IR jest zamknięta, sprawdzając to za pomocą karty IR.
9. Selekcja i manipulacja patogenem za pomocą pułapki optycznej
- Ustaw ostrość na makrofagi na przytwierdzonym szkiełku.
- Znajdź patogeny swobodnie unoszące się w roztworze w sąsiedztwie makrofagów.
- Przesuń stolik tak, aby patogen znalazł się w pobliżu pułapki.
- Otwórz migawkę i aktywuj pułapkę.
- Przesuń próbkę, aby doprowadzić do kontaktu makrofagów ze stacjonarnym, schwytanym patogenem.
- Wykonaj obrazowanie za pomocą konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym, w trybie DIC, fluorescencji lub w obu tych trybach jednocześnie. Zazwyczaj chwytanie odbywa się w trybie DIC, a obrazowanie w czasie rzeczywistym w trybie fluorescencji.
10. Reprezentatywne wyniki:
Aby uzyskać pełną kontrolę przestrzenną i czasową nad patogenami i koralikami w środowisku in vivo oraz in vitro, zaprojektowaliśmy specjalistyczne urządzenie do pułapkowania zintegrowane z konfokalnym mikroskopem dyskowym (schemat przedstawiono na Rys. 1). Przy pełnej mocy laser dostarczał 350 mW, a po sprzężeniu światła z różnymi komponentami optycznymi w urządzeniu pułapki optycznej, do utworzenia pułapki w komorze wykorzystano moc ˜80 mW na obiektywie TIRF, zmierzoną za pomocą miernika mocy.
Aby ustawić obiekt w komorze względem obiektu uwięzionego, przesuwano stolik, utrzymując obiekt uwięziony w miejscu za pomocą lasera pułapkującego. Stolik przesuwano z prędkościami na tyle niskimi, aby siła oporu działająca na uwięzioną cząstkę nie przekroczyła maksymalnej siły pułapkowania.
Osobne populacje C. albicans (typowy rozmiar – ˜5 μm) zostały oznakowane każdym z trzech kolorów (AF488, AF568 oraz AF647, odpowiadającymi odpowiednio kolorom zielonemu, niebieskiemu i czerwonemu na rysunku), aby zilustrować obrazowanie z wykorzystaniem wielu kanałów fluorescencji przy jednoczesnym optycznym chwytaniu patogenu. Pojedyncza komórka C. albicans została schwytana i przemieszczana po kwadratowym torze przez skupisko innych drożdży, co wskazują szare strzałki, wykazując zdolność do przechwytywania i manipulowania konkretną lokalizacją pojedynczego patogenu wybranego przez operatora, nawet w zatłoczonym środowisku (Rys. 2A).
Aby dalej zilustrować elastyczność tego systemu w chwytaniu różnych morfologii kształtów wykazywanych przez organizmy patogenne, pęseta optyczna była również w stanie utrzymać i ustawić cząsteczkę C. albicans z pseudohifą. C. albicans znakowany AF647 (czerwony) był przemieszczany wzdłuż trajektorii zaznaczonej białą strzałką i umieszczony obok fluorescencyjnych komórek GFP-LC3-RAW (Rys. 2B). Część drożdżowa C. albicans została uwięziona, podczas gdy pseudohifa ciągnęła się za nią.
Umieściliśmy również Aspergillus fumigatus obok mysiej makrofagi RAW, aby przeanalizować bezwzględny ramy czasowe fagocytozy w przypadku tej konkretnej linii komórkowej i patogenu (Rys. 3A). W momencie, gdy patogen nawiąże kontakt z komórką, pułapka optyczna jest wyłączana, a następnie stosuje się obrazowanie poklatkowe w celu obserwacji następujących zdarzeń komórkowych (Rys. 3B). Pułapkę optyczną wykorzystano również do przechwycenia pierwotnych limfocytów T wyizolowanych z krwi i skierowania ich w sąsiedztwo kulek pokrytych przeciwciałem anty-CD3, aby limfocyt T mógł utworzyć synapsę immunologiczną z kulką (Rys. 4), co demonstruje dodatkową wszechstronność w bezpośrednim chwytaniu i manipulowaniu komórkami odpornościowymi.
Rycina 1. Przegląd i schemat połączonego układu pułapki optycznej i konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym. Układ instrumentu przedstawiający wiązkę pułapkującą (fioletowa), tor oświetlenia do obrazowania w jasnym polu (pomarańczowy), wiązkę wzbudzenia fluorescencji (czerwona), emisję fluorescencji (zielona), kamerę o ładunku sprzężonym (CCD), kamerę z mnożeniem ładunku (EM-CCD), lustra dichroiczne (D1 i D2), lustra (M1 i M2) oraz soczewki (L1, L2, L3, L4). Wszystkie pozostałe elementy systemu mikroskopu pułapka-konfokal są opisane na rycinie.
Rysunek 2. (A) Obrazy fluorescencyjne uwięzionych i manipulowanych C. albicans. Uwięziony organizm znakowany fluorescencyjnie (Alexa Fluor 488 (AF488), niebieski) w polu innych znakowanych fluorescencyjnie C. albicans (AF568, zielony i AF647, czerwony). Stolik mikroskopu jest przesuwany wokół uwięzionej, niebieskiej cząsteczki CA, zgodnie ze wskazaniem szarych strzałek. (B) Uwięziona forma pseudohifowa C. albicans obok komórki RAW z GFP-LC3. Znakowana fluorescencyjnie forma pseudohifowa CA (czerwona, AF647) uwięziona optycznie i przesunięta w sąsiedztwo makrofagów RAW wykazujących ekspresję GFP-LC3. Organizm CA jest przemieszczany wzdłuż trajektorii wskazanej przez białą strzałkę.
Rysunek 3. Wychwytywanie i pozycjonowanie A. fumigatus obok fagocytującej komórki RAW. (A) Obrazy w polu jasnym wychwyconego A. fumigatus, wskazanego białą strzałką, przemieszczanego i pozycjonowanego wzdłuż ścieżki wskazanej czerwoną strzałką. Wychwycony patogen znajduje się lekko poza ostrością, ponieważ pułapka wypycha organizm nieco powyżej płaszczyzny ogniskowej. A. fumigatus jest przemieszczany aż do momentu umieszczenia go obok wybranej komórki RAW. (B) Obrazowanie fluorescencyjne fagocytozy A. fumigatus przez komórkę RAW. Po umieszczeniu wychwyconego patogenu obok komórki RAW aktywowany jest proces fagocytozy. W 30 s błona komórki RAW zaczyna ulegać zmianie i formować puchar wokół cząsteczki. W 60 s puchar jest w pełni uformowany. Od 90 s do 150 s A. fumigatus jest pochłaniany, a do 180 s cząsteczka zostaje całkowicie zinternalizowana
Rycina 4. Pułapkowanie pierwotnej komórki T w celu utworzenia synapsy z kuleczkami powlekanymi przeciwciałem anty-CD3. Obrazy DIC pierwotnej komórki T przemieszczonej za pomocą pułapki optycznej na pozycję obok kuleczki powlekanej przeciwciałem anty-CD3. Następnie komórka tworzy synapsę immunologiczną, której nie można łatwo rozpoznać na obrazach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy wykorzystujemy pułapkę optyczną do wychwytywania patogenów o rozmiarach od 3 μm do 5 μm. Choć patogeny będące przedmiotem zainteresowania naszego laboratorium zazwyczaj mają takie wymiary, opisany tutaj system pęsety optycznej jest na tyle elastyczny, że pozwala na pułapkowanie cząstek o szerokim zakresie wielkości. Rzeczywiście, pułapki optyczne są stosowane do wychwytywania obiektów o rozmiarach od pojedynczych atomów po komórki o średnicy około 10 μm. Ponadto ten system pułapkowania optycznego umożl...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez fundusze wewnętrzne Wydziału Medycyny Massachusetts General Hospital (J.M.T., M.K.M, M.L.C., J.M.V.), grant T32EB006348 Narodowego Instytutu Obrazowania Biomedycznego i Bioinżynierii (C.E.C.), fundusz rozwoju Centrum Biologii Obliczeniowej i Integracyjnej Massachusetts General Hospital oraz grant AI062773 (R.J.H.), granty AI062773, DK83756 i DK 043351 (R.J.X.), NSF 0643745 (M.J.L.), NIH R21CA133576 (M.J.L.) oraz grant AI057999 Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID) Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) (J.M.V.). Dziękujemy Nicholasowi C. Yoderowi za pomocne dyskusje oraz Charlesowi Feltsowi (RPI, Inc.) za pomoc techniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| *A. fumigatus* | szczep albinos, B-5233/RGD12-8, dar od K.J. Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | mutant SSY50-B, dar od Eleftheriosa Mylonakisa, MGH; szczep SC5314, dar od Geralda Finka, Whitehead Institute | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimetylformamid | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Świeża krew | Dar od R.J.W. Heath, MGH, HMS | ||
| odwrócony mikroskop Nikon | Nikon Instruments | Model Ti-E | |
| Laser do pułapkowania, ChromaLase | Badania podstawowe | CLAS-106-STF02-02 | |
| Laser do wzbudzania fluorescencji | Coherent Inc. | Model Innova 70C | |
| Płytki stykowe do unieruchamiania komponentów | Thorlabs Inc. | MB1224, MB1218 | |
| Optyczny stół pneumatyczny | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Elektroniczna migawka z sterowaniem pedałem | Uniblitz | Zakupione w firmie Vincent Associates, Rochester, NY | |
| Jednomodowe światłowody optyczne | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Pozycjoner światłowodowy | Thorlabs Inc. | PAF-X-5-C | |
| Kolimator światłowodowy | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Soczewki do teleskopu | Thorlabs Inc. | AC254-150-B | Ogniskowa 150 mm |
| Etapy translacji (x, y, z) | Newport Corp. | M-461-XYZ | |
| lustro dichroiczne IR | Chroma Technology Corp. | ET750-sp-2p8 | |
| Obiektyw (100X) | Nikon Instruments | NA = 1,49, imersja olejowa, obiektyw TIRF | |
| Głowica konfokalna | Yokogawa | CSU-XI | |
| Polaryzator | Instrumenty Nikon | MEN51941 | |
| pryzmat Wollastona | Nikon Instruments | MBH76190 | |
| kamera EM-CCD | Hamamatsu Corp. | C9100-13 | |
| kamera CCD (ORCA ER) | Hamamatsu Corp. | C4742-80-12AG | |
| Koło filtrów | Ludl | 99A353 | |
| Koło filtrów | Sutter Instrument Co. | LB10-NWE | |
| Szkiełko nakrywkowe z komorką | Lab-Tek | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Pokryte przeciwciałami anty-CD3 |
| Dulbecco’zmodyfikowane medium Eagle’pożywka (DMEM) | Invitrogen | 10313 | |
| Penicylina/streptomycyna | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-glutamina | Invitrogen | 25030-081 | |
| płodowa surowica bydlęca (HyClone) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30071.03 |
Bibliografia
- Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).
- Ashkin, A. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).
- Ashkin, A., Dziedzic, J. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science. Nature. 235, 1517-1520 (1987).
- Khalil, A. S. Single M13 bacteriophage tethering and stretching. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).
- Khalil, A. S. Kinesin's cover-neck bundle folds forward to generate force. Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).
- Li, Z. Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers. Biophys J. , 1386-1395 (2002).
- Kim, S. The αβ T cell receptor is an anisotropic mechanosensor. J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).
- Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers. Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).
- Tam, J. Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions. PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature. Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).
- Wey, S. B. Hospital-acquired candidemia - the attributable mortality and excess length of stay. Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
