Podskórne podawanie antagonistów muskarynowych oraz potrójne barwienie immunocytochemiczne mięśnia dźwigacza małżowiny usznej u myszy

Podsumowanie

Opisujemy procedury powtarzalnego podawania inhibitorów sygnalizacji muskarynowej do mięśnia dźwigacza małżowiny usznej (LAL) u młodych dorosłych myszy oraz późniejszego barwienia immunocytochemicznego jego złącz neuromięśniowych (NMJs) w preparatach całych organów. Mięsień LAL posiada wyjątkowe zalety w kontekście ujawniania farmakologicznych efektów in vivo w złączach NMJs.

Streszczenie

Mięśnie kończyn tylnych gryzoni, takie jak mięsień brzuchaty łydki i mięsień piszczelowy przedni, są często wykorzystywane w badaniach farmakologicznych in vivo nad sygnałami kluczowymi dla tworzenia i utrzymania połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ) u ssaków. Jednakże penetracja leku do tych mięśni po podaniu podskórnym lub domięśniowym jest często niepełna lub nierównomierna, przez co wiele NMJ może pozostać nienaruszonych. Choć podawanie systemowe za pomocą urządzeń takich jak minipompy może poprawić efekty czasowo-przestrzenne, inwazyjny charakter tego podejścia może wywołać utrudniające interpretację reakcje zapalne i/lub bezpośrednie uszkodzenie mięśni. Ponadto pełna analiza NMJ w mięśniu kończyny tylnej jest trudna, ponieważ wymaga czasochłonnego seryjnego cięcia i rozległego barwienia immunocytochemicznego.

Mysi mięsień LAL (levator auris longus) to cienki, płaski płat mięśniowy położony powierzchownie na grzbiecie szyi. Jest to mięsień szybkokurczliwy, którego funkcją jest poruszanie małżowiną uszną. Składa się z części rostralnej i kaudalnej, które biorą początek w linii środkowej czaszki i rozciągają się bocznie do części chrzęstnej każdej małżowiny. Mięsień jest zaopatrywany przez gałąź nerwu twarzowego, która biegnie w kierunku kaudalnym po opuszczeniu otworu stylomastoidalnego. My oraz inni badacze stwierdziliśmy, że LAL jest wygodnym preparatem, który oferuje zalety w badaniu zarówno krótkoterminowych, jak i długoterminowych efektów działania leków na połączenia nerwowo-mięśniowe (NMJ) i mięśnie in vivo. Po pierwsze, jego powierzchowne położenie ułatwia wielokrotne miejscowe podawanie leków w lekkiej anestezji. Po drugie, jego cienkość (2-3 warstwy włókien mięśniowych) umożliwia wizualizację i analizę niemal wszystkich NMJ w obrębie mięśnia. Po trzecie, łatwość wypreparowania go wraz z nienaruszonym nerwem, w połączeniu ze wzorcem jego unerwienia, pozwala na dodatkową analizę elektrofizjologiczną in vitro^9,5. Wreszcie, i być może najważniejsze, niewielka objętość podanego preparatu (˜50μl) łatwo pokrywa całą powierzchnię mięśnia, zapewnia równomierną i przedłużoną ekspozycję wszystkich jego NMJ na lek i eliminuje konieczność stosowania metod systemowych^1,8.

Protokół

1. Podskórne podawanie antagonistów muskarynowych receptorów acetylocholiny (mAChR)

1. W warunkach aseptycznych przygotować odpowiednią dawkę antagonisty mAChR (por. tabela), rozpuszczając lek w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Wykorzystano następujące antagonisty: atropinę, metoktraminę, 4-DAMP, AFDX-16, AFDX-384 oraz MT 7.
2. Rysuj 50μl roztworu do strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml i używaj osobnej strzykawki dla każdej myszy. Przygotuj również strzykawki zawierające wyłącznie sól fizjologiczną dla każdej myszy w grupie kontrolnej. Przechowuj strzykawki w lodzie do momentu wykonania wtryskiwania.
3. Zanurzyć myszy w znieczuleniu za pomocą mieszaniny ketaminy i ksylazyny (120 mg/kg ketaminy, 8 mg/kg ksylazyny). Sprawdzić, czy osiągnięto odpowiednią głębokość znieczulenia, obserwując brak reakcji na uciśnięcie palca u stopy.
4. Po zastosowaniu odpowiedniej sedacji należy ogolić włosy od przedniej części głowy do tylnej części szyi, a następnie usunąć pozostałe włosy za pomocą 70% etanolu.
5. Umieść mysz pod stereomikroskopem i wprowadź igłę równolegle do mięśnia LAL, lekko odciągając tłok strzykawki (Ryc. 1A,B). Zapewnia to, że igła zostanie wprowadzona w znajdującą się powyżej tkankę łączną i nie uszkodzi bezpośrednio samego mięśnia LAL. Wprowadź igłę tak, aby jej końcówka pokrywała końcową część mięśnia LAL.
6. Należy bardzo powoli zacząć wstrzykiwać roztwór nad prawy mięsień LAL, jednocześnie wycofując strzykawkę; całkowity czas wstrzykiwania powinien wynosić około 1 minuty. Przy prawidłowym wstrzyknięciu w skórze nad mięśniem powinien utworzyć się „kopułka” o średnicy około 1 cm, która utrzyma się przez co najmniej jedną godzinę. Jednolicie wstrzyknięty roztwór powinien pokryć całe obszary rostralny i kaudalny prawego mięśnia LAL.
7. Powtarzać procedurę co 12 godzin przez okres od 1 do 7 dni. W innych badaniach1 zastosowano ten sam protokół w celu wstrzykiwania czynników wzrostu co 12 godzin przez okres do 21 dni. Nie zaobserwowano żadnych nieprawidłowych reakcji u myszy, którym podawano znieczulenie 2 razy dziennie przez okres do 21 dni.

2. Disekcja mięśni LAL

1. Uśmierć myszy poprzez przedawkowanie pentobarbitalu sodowego (390 mg/kg). Śmierć potwierdza się poprzez stwierdzenie braku bicia serca po wykonaniu torakotomii.
2. Przytwierdź mysz w naczyniu sekcyjnym, stroną grzbietową do góry, używając jednej szpilki w każdej łapie i jednej szpilki przez nos.
3. Wykonaj pierwsze nacięcie tylko przez skórę, używając małych nożyczek sprężynowych, prowadząc cięcie wzdłuż lewego mięśnia LAL od obszaru bezpośrednio proksymalnie od ucha do obszaru wokół lewej łopatki.
4. Ostrożnie usuń skórę w tym regionie, unikając cięcia zbyt blisko prawego ucha, ponieważ jest to jeden z punktów przyczepu prawego mięśnia LAL.
5. Zlokalizuj centralnie położony pas tkanki tłuszczowej wzdłuż linii środkowej na powierzchni powierzchownej głowy, w miejscu styku prawego i lewego mięśnia LAL. Używając małych nożyczek sprężynowych, wykonaj nacięcie 1 cm na prawo od tkanki tłuszczowej (w stronę lewego ucha) od krawędzi proksymalnej lewego mięśnia LAL aż do łopatki (Ryc. 1C).
6. Po wykonaniu nacięcia odsunij prawy mięsień LAL małą pęsetą, aby odsłonić jego stronę brzuszną. Usuń tkankę łączną i powięź, ostrożnie podciągając prawy mięsień LAL pęsetą (Ryc. 1C).
7. Wytnij prawy mięsień LAL wokół jego końca ogonowego u nasady ucha. Kontynuuj cięcie, przesuwając się w stronę końca rostralnego prawego ucha, utrzymując prawy mięsień LAL w pozycji odwróconej (Ryc. 1C).. Na tym etapie lepiej pozostawić więcej tkanki, niż ryzykować uszkodzenie samego mięśnia LAL. Jeśli mięsień zacznie wysychać, nanieś pipetą 1X PBS na mięsień.
8. Umieść wypreparowany prawy mięsień LAL stroną grzbietową do góry w 30-milimetrowej szalce hodowlanej Sylgard zawierającej 1X PBS. Przytwierdź cztery narożniki mięśnia za pomocą małych szpilek entomologicznych.
9. Używając małej pęsety i nożyczek sprężynowych, oczyść tkankę łączną z powierzchni grzbietowej i brzusznej prawego mięśnia LAL. Odwróć mięsień i ponownie go przytwierdź, aby oczyścić powierzchnię brzuszną. W jednej 30-milimetrowej szalce można umieścić 2-3 mięśnie.

3. Potrójne barwienie immunocytochemiczne złączy nerwowo-mięśniowych LAL: Dzień 1

1. Przed rozpoczęciem immunostainingu należy przygotować wszystkie niezbędne odczynniki. Wymagane będą: 1X PBS, 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBS, 0,1M glicyny w 2% BSA/PBS, 0,2% Triton X10 w 2% BSA/PBS oraz 4% paraformaldehydu (PFA) w 1X PBS. Metanol należy schłodzić w zamrażarce w temperaturze -20°C.
2. Podczas tego procesu mięśnie LAL powinny pozostać przypięte w naczyniu stroną grzbietową do góry. Odlać roztwór 1X PBS i dodać odpowiednią ilość 4% (PFA), aby pokryć mięsień. Naczynie umieścić na wytrząsaniu ustawionym na prędkość 2 lub 3 na 20 minut. O ile nie zaznaczono inaczej, w kolejnych krokach naczynie powinno znajdować się na wytrząsarce.
3. Odlać 4% PFA i przemyć mięsień 1X PBS trzykrotnie, po 10 minut każdy raz.
4. Odlać ostatni przemywany roztwór 1X PBS i dodać roztwór 0,1M glicyny w 2% BSA/PBS na 30 minut.
5. Odlać roztwór 0,1M glicyny i dodać 1X PBS zawierający $\alpha$-bungarotoksynę sprzężoną z rodamyną w stężeniu 1:20 na 15 minut.
6. Odlać roztwór $\alpha$-bungarotoksyny i przemyć mięsień w 1X PBS trzykrotnie, po 10 minut każdy raz.
7. Przeprowadzić permeabilizację tkanki, dodając schłodzony metanol, a następnie umieścić naczynie w zamrażarce w temperaturze -20°C dokładnie na 5 minut, bez wytrząsania.
8. Usunąć metanol i przemyć trzykrotnie po 10 minut za pomocą 1X PBS. Odlać ostatni przemywany roztwór i zablokować tkankę za pomocą 0,2% Triton X-10 w 2% BSA/PBS przez 1 godzinę. Kroki przemywania i blokowania wykonuje się w temperaturze pokojowej.
9. Inkubować mięśnie przez noc, z wytrząsaniem, w temperaturze 4°C w koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w roztworze blokującym (patrz tabela).

4. Potrójne barwienie immunocytochemiczne złączy nerwowo-mięśniowych (NMJ) LAL: Dzień 2

1. Przemyć mięśnie w 1X PBS 3 razy, po 10 minut każde, w temperaturze pokojowej.
2. Dodać koktajl przeciwciał wtórnych w roztworze blokującym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (por. tabela). Od tego momentu mięśnie muszą być chronione przed światłem, aby zapobiec fotoblaknięciu fluorescencji Alexa-Fluor 647.
3. Przemyć mięśnie w 1X PBS 3 razy, po 10 minut każde.
4. Usunąć pozostałą tkankę łączną w 1X PBS, odciąć krawędzie boczne mięśni LAL i zamocować na szkiełkach przedmiotowych stroną grzbietową do góry, używając szkiełek zakrywek i medium montującego. Użyć bezbarwnego lakieru do paznokci, aby przymocować zakrywkę.
5. Chronić szkiełka przed światłem i przechowywać w temperaturze -20°C do momentu analizy.

5. Obrazowanie konfokalne połączeń NMJ w LAL

1. Obrazy konfokalne o wysokiej rozdzielczości pozyskano przy użyciu obiektywu olejowego Leica Plan Apo 63X (1.4NA) na mikroskopie konfokalnym Leica TCS 4D.
2. Sygnały fluoresceiny oraz Alexa 647 skanowano jednocześnie, odpowiednio liniami laserowymi 48 nm (Argon, 48 nm, 20 mW) i 633 nm (HeNe, 63 nm, 10 mW). Następnie sekwencyjnie skanowano sygnał rodaminy linią laserową 561 nm (DPSS, 561, 20 mW). Przekroje optyczne zbierano w odstępach 0.3 μm, a liczba obrazów w płaszczyźnie z wynosiła od 60 do 80. Apertura diaphragm (pinhole) została ustawiona na Airy 1 (107.97 um). Format obrazu 1024 x 1024 (X,Y) przy powiększeniu (zoom) 1 i prędkości 40Hz daje rozmiar obrazu 234.32 μm x 234.32 μm oraz rozmiar piksela 229.05 nm x 29.05 nm.
3. Następnie użyto oprogramowania akwizycyjnego Leica TCS-NT do rekonstrukcji serii obrazów z w celu uzyskania maksymalnych projekcji intensywności.
4. Jasność i kontrast obrazów wielopanelowych dostosowano w programie Adobe Photoshop.
5. W przypadku typowego mięśnia LAL powinno być możliwe przeanalizowanie około 75-10 połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ) en face. Stabilność synaptyczną określa się na podstawie takich cech jak przestrzenne dopasowanie elementów presynaptycznych, perysynaptycznych i postsynaptycznych (tj. nerwu, komórek Schwanna i mięśnia) oraz pomiarów powierzchni synaptycznej (tj. wielkości synapsy).

Reprezentatywne wyniki:

W dorosłym ssaczym NMJ pojedynczy akson ruchowy tworzy drobne rozgałęzienia, które formują wysoce zróżnicowane drzewa zakończeń nerwowych (Ryc. 2; zielone) na pojedynczym włóknie mięśniowym, precyzyjnie przylegając do postsynaptycznych skupisk nikotynowych AChR (Ryc. 2; czerwone). W obszarze perysynaptycznym terminalne komórki Schwanna ściśle pokrywają wszystkie gałęzie presynaptycznych zakończeń nerwowych (Ryc. 2; niebieskie). Integralność strukturalna i funkcjonalna tej trójdzielnej organizacji zostaje poważnie zaburzona przez codzienne stosowanie inhibitorów mAChR specyficznych dla danego podtypu. W przedstawionym tutaj przykładzie (Ryc. 3) 4-DAMP, antagonista mAChR o wysokim powinowactwie do podtypów M1, M3, M4 i M5 mAChR, wywołuje selektywną eliminację zakończeń nerwowych z licznych NMJ na całej powierzchni mięśnia (Ryc. 3B, C). Ponadto terminalne komórki Schwanna wykazują nieprawidłową spoczynkowość⁸, co potwierdza jasne znakowanie S10 bez wydłużenia wypustek (Ryc. 3B", 3C"). Postsynaptycznie włókna mięśniowe pozostają prawidłowe i nie stwierdzono utraty nAChR (Ryc. 3B', 3C').

Rysunek 1. Lokalizacja anatomiczna i organizacja mięśnia LAL. Przedstawiono lokalizację części rostralnej (rLAL), caudalnej (cLAL) oraz nerwu LAL (LALn) i odpowiadających im pasm blaszek końcowych (A, wstawka). Przedstawiono lokalizację i orientację igły względem mięśnia LAL dla procedury iniekcji (B). Przedstawiono miejsca nacięć dla procedury sekcji (C).

Rysunek 2. Trójdzielna organizacja złącza neuromięśniowego (NMJ). Widoki konfokalne z dużym powiększeniem NMJ myszy. Pojedynczy akson tworzy drobne gałązki końcowe (A), ściśle pokryte przez terminalne komórki Schwanna i ich wypustki (A', gwiazdki wskazują ciała terminalnych komórek Schwanna). Po stronie postsynaptycznej, w włóknie mięśniowym, skupisko nikotynowych receptorów AChR znajduje się w precyzyjnym sąsiedztwie gałęzi zakończeń nerwowych i terminalnych komórek Schwanna.

Rysunek 3. Mięśnie LAL traktowane 4-DAMP, antagonistą mAChR. Obrazy konfokalne mięśni LAL traktowanych wehikułem lub 4-DAMP w małym i dużym powiększeniu. W przeciwieństwie do mięśnia traktowanego wehikułem (A-A'''), liczne NMJ w mięśniu traktowanym 4-DAMP nie wykazują obecności zakończeń nerwowych (B-B''', C-C'''). Obszar zaznaczony ramką na Ryc. 2B został powiększony na Ryc. 2C.

Dyskusja

Metoda przedstawiona w niniejszej pracy umożliwia badanie wcześniej nierozpoznanych ról sygnalizacji mAChR specyficznej dla podtypu w stabilności i utrzymaniu ssaczych złączy nerwowo-mięśniowych (NMJ). Metoda ta będzie również przydatna do testowania efektów czynników neurotroficznych i środków farmakologicznych. Na przykład nasze laboratorium odkryło, że czynnik neurotroficzny rzęsek (CNTF) wywołał kiełkowanie niemal wszystkich zakończeń nerwowych w mięśniu LAL u dorosłych myszy¹. Wynik ten kontrastował z wcz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ketamina	Hospira Inc.	NDC0409-2051-05	Dawka: 120mg/kg
ksylazyna	Lloyd, Inc.	LA33806	Dawka: 8mg/kg
atropina	Sigma-Aldrich	A0132	(>98% czystości); Dawka: 0.2mg/kg — 20mg/kg
atropina	Voigt Global Distribution	AT105	Klasa farmaceutyczna
Metoktramina	Sigma-Aldrich	M105	Dawka: 100 - 400M
4-DAMP	Sigma-Aldrich	D142	Dawka: 2.5mg/kg
AFDX-116	Tocris Bioscience	1105	250M
AFDX-384	Tocris Bioscience	1345	50M - 500M
MT 7	Peptides International	PMT-4340-s	0.1M - 1M
1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4	Invitrogen	10010049
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	T353-500	Najpierw przygotować 10% roztwór, rozpuszczając 10g w 100mL zdejonizowanej wody destylowanej; przygotować roztwór 4% w 1X PBS, dostosowując pH do 7.4
Pentobarbital sodowy	Virbac Animal Health	NDC-051311-050-01	Dawka: 390mg/kg
Sylgard	Dow Corning	Part # 184	Postępować zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu; można stosować szalki hodowlane o różnych rozmiarach (30mm, 60mm, 100mm) w zależności od potrzeb
0.1M glicyna	Sigma-Aldrich	G-7126	Dodać 0.185g do 25mL 2% BSA/PBS
2% albuminy surowicy bydlęcej (2% BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100g	Rozpuścić 2g BSA w 100mL 1X PBS
0.2% Triton X100 w 2% BSA/PBS (bufor blokujący)	Sigma-Aldrich	T9284-100mL	Rozpuścić 0.2ml w 100mL 2% BSA/PBS
α-bungarotoksyna	Invitrogen	T1175	Stosować w stężeniu 1:200
SMI-312	Sternberger Monoclonals Inc.	SMI312	Stosować w stężeniu 1:1000
SV2	Developmental Studies Hybridoma Bank	SV2-Supernatant	Stosować w stężeniu 1:10
S100	Dako	Z0311	Stosować w stężeniu 1:400
FITC- kozie przeciwciało anty-mysie IgG1	Roche Group	03117731001	Stosować w stężeniu 1:200, lecz w przypadku wysokiego tła spróbować 1:400
sprzężone z Alexa-Fluor 647 kozie przeciwciało anty-królicze	Invitrogen	A21244	Stosować w stężeniu 1:200
fluorescencyjne medium montażowe Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Nie jest to medium utwardzające; szkiełko przykrywowe należy zabezpieczyć bezbarwnym lakierem do paznokci.
Małe nożyczki sprężynowe	Fine Science Tools	15002-08
Pinceta do sekcji	Fine Science Tools	11295-51