$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Tworzenie zestawów słuchawkowych z dwiema elektrodami bipolarnymi (Rysunek 1)
- Wytnij 3,5 cm drutu ze stali nierdzewnej pokrytego politetrafluoroetylenem.
- Zdejmij około 1 mm warstwy izolacyjnej z drutu na obu końcach. Nie zdejmuj zbyt dużej izolacji z przewodu.
- Umieść dwa kołki na uchwycie imadła dolną częścią kołka, która ma dłuższą szczelinę skierowaną w dół.
- Nałóż topnik na odizolowane końce drutu i na wierzchołki kołków.
- Ocynuj odizolowaną część drutu wystarczającą ilością lutu, aby go pokryć.
- Dodaj minimalną ilość lutu na górę kołka, nie przelewając się na boki.
- Umieść jeden koniec odizolowanych końców drutu w szpilce tak głęboko, jak to możliwe, podczas gdy lut jest topiony.
nuta: Jest boczny otwór, z którego może wyjść drut - nie pozwól, aby drut wyszedł z kołka. Cały odizolowany drut musi pozostać w obrębie kołka.
- Powtórz kroki 1.6-1.7 dla drugiego pinu, teraz z pozostałymi odizolowanymi końcami drutu.
- Pozostaw kołki na 30 sekund, aby się ustawiły, wyjmij je z uchwytu imadła, a następnie pociągnij za nie, aby upewnić się, że połączenie między drutem a kołkami jest mocne i trzyma się.
- Opłucz szpilki w zimnej wodzie, a następnie wysusz.
- Sprawdź przewodność między pinem 1 a pinem 2 za pomocą omomierza.
- Zbliż do siebie kołki na końcach drutu; trzymaj je równolegle i blisko. Zacisnąć hemostat na środku drutu. Następnie obróć hemostat, aby drut owinął się wokół siebie dość mocno. Usuń hemostat.
- Zacisnąć kleszczyki na skręconym drucie 2 mm poniżej kołków i zegnij drut pod kątem 90°.
- Ponownie popchnij ten sam drut pod kątem 90° z powrotem przez kleszcze, tworząc kolejne zagięcie 1 mm od pierwszego.
- Przetnij skręcony drut pod kątem 45° poniżej zagięcia na 3,5 mm małymi ostrymi nożyczkami.
- Przygotuj dwie z tych dwubiegunowych (skręconych dwupinowych) elektrod dla każdego zestawu słuchawkowego (opcjonalnie, druga to kopia zapasowa w przypadku problemów elektrycznych z pierwszą).
- Przygotuj pojedynczą elektrodę referencyjną, przecinając drut z kołkami przylutowanymi na obu końcach na dwie części (kroki 1.1-1.17, Rysunek 1A).
- Przetnij drut na 7 mm.
- Zegnij koniec 1 mm poniżej końcówki.
- Następnie przykryj wygiętą końcówkę drutu o średnicy 1 mm kleszczykami i mocno obróć drut wokół kleszczy, aby utworzyć małą pętlę (o średnicy 1 mm).
- Zegnij pętlę prostopadle do prostej części drutu, aby końcówka drutu była ponownie skierowana na zewnątrz.
- Zamontuj dwie elektrody bipolarne i pojedynczą elektrodę odniesienia w sześciopinowym cokole w taki sposób, aby elektrody bipolarne znajdowały się obok siebie w odległości 6 mm między nimi, a elektroda referencyjna była umieszczona w środkowym zewnętrznym otworze (Rysunek 1B).
nuta: Alternatywną metodą jest wszczepienie elektrod, zacementowanie ich na miejscu, a następnie włożenie ich kołków w cokół.
2. Stereotaktyczne wszczepienie elektrody
- Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i sześciopinowy zespół elektrod przez autoklawowanie przed operacją. Podczas operacji należy zachować sterylne pole operacyjne i używać sterylnych rękawic chirurgicznych. Sterylne obłożenia (np. Press n' Seal) są zalecane do przykrycia zwierzęcia z wyjątkiem obszaru operacyjnego.
- Użyj 8-tygodniowych myszy VGAT-Cre (eksprymujących rekombinazę Cre pod kontrolą genu pęcherzykowego transportera GABA [VGAT], dopasowanych do wieku, zarówno samców, jak i samic) do operacji 4 tygodnie po odsadzeniu. Zapisz wagę zwierzęcia przed operacją, aby umożliwić pomiar utraty masy ciała po operacji.
- Używaj certyfikowanego waporyzatora izofluranu lub systemu anestezjologicznego o niskim przepływie wyposażonego w precyzyjną pompę strzykawkową, zintegrowany parownik cyfrowy i poduszkę termiczną ze sprzężeniem zwrotnym.
nuta: Systemy o niskim przepływie są w stanie dostarczyć znieczulenie o niskim natężeniu przepływu proporcjonalnym do wielkości zwierzęcia do komory indukcyjnej lub przez stożek nosowy na ramie stereotaktycznej (70 ml/min, stężenie izofluranu w powietrzu wynosi 4% dla indukcji i 2% dla operacji). Stosowanie mniejszej ilości znieczulenia nie tylko przynosi korzyści zwierzęciu podczas operacji, ale także zmniejsza ryzyko narażenia personelu laboratoryjnego na izofluran.
- Umieść znieczulone zwierzę na podgrzewanej podkładce rozgrzanej do 37 °C, aby utrzymać ją w cieple podczas operacji. W przypadku korzystania z systemu temperatury sterowanego sprzężeniem zwrotnym, włóż lekko nasmarowaną sondę temperatury do odbytnicy zwierzęcia w celu monitorowania temperatury podczas operacji.
- Zamontuj zwierzę na ramie stereotaktycznej, delikatnie umieszczając nauszniki w uszach, a przednie górne zęby w siekaczu. Umieść stożek nosowy nad nosem, aby zapewnić prawidłowe podanie znieczulenia. Upewnij się, że głowa jest wypoziomowana i wyśrodkowana i nie można jej przesunąć przy lekkim sondowaniu.
- Podskórnie wstrzyknąć 0,5 ml normozolu w celu nawodnienia.
- Zastosuj lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
- Monitoruj głębokość znieczulenia przez brak odruchu wycofania po uszczypnięciu palca kończyny tylnej, a następnie zmniejsz izofluran do 1,5%-2,0% podczas operacji.
- Usuń włosy w okolicy operacyjnej i wokół niej, wyrywając lub używając maszynki do strzyżenia (golenia) lub kremu do depilacji, a następnie zdezynfekuj skórę trzema cyklami naprzemiennego stosowania jodu i etanolu, kończąc jodem. Usuwanie włosów z miejsca operowanego jest zalecane tylko wtedy, gdy istnieją środki do utrzymania znieczulenia w tym miejscu. W razie potrzeby użyj aplikatorów z bawełnianą końcówką nasączoną alkoholem, aby usunąć włosy z bezpośredniego obszaru otaczającego głowę. Wstrzyknąć podskórnie 0,05 ml miejscowej przeciwbólowej bupiwakainy (0,25%).
- Wykonaj nacięcie na czaszce za pomocą skalpela, a następnie wytnij część skóry ostrymi nożyczkami chirurgicznymi, odsłaniając czaszkę. Odsuwając skórę na bok, za pomocą bawełnianego wacika oczyść czaszkę ze wszystkich mięśni i tkanek zasłaniających widok.
nuta: Aby zatamować przypadkowe krwawienie, należy uciskać miejsce krwawienia sterylnym wacikiem, aż do jego ustania.
- Oczyść czaszkę wodą utlenioną za pomocą sterylnych wacików, aby widoczne były szwy czaszki oraz bregma i lambda.
- Dokładnie osusz czaszkę, a następnie nałóż jedną kroplę samotrawiącego kleju dentystycznego za pomocą aplikatora. Wmasuj go w czaszkę, odczekaj 60 s i utwardź dentystycznym światłem UV przez 40 sekund. Błyszcząca powierzchnia wskazuje, że klej został skutecznie usieciowany z czaszką.
nuta: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla bezpiecznego zamocowania zestawu słuchawkowego.
- Użyj wiertła 0,031" (0,79 mm), aby obustronnie wywiercić dwa otwory na zadziory w celu wszczepienia elektrod głębokości hipokampa (około 5,000 obr./min). Wywierć jeden dodatkowy otwór na elektrodę odniesienia nad móżdżkiem za lambda.
UWAGA: Podczas wiercenia należy uważać, aby powoli opuszczać wiertło i unikać wwiercania się w mózg.
- Współrzędne elektrod są następujące (z bregma w mm): elektrody hipokampa na głębokości 3 mm z tyłu, 3 mm bocznej i 3 mm oraz elektroda referencyjna móżdżku na głębokości 6 mm z tyłu, 0 mm bocznej i 0 mm (podtwardówkowa).
- Aby zwiększyć dokładność, użyj wiertła zamontowanego stereotaktycznie, wyzeruj oś X/Y manipulatora stereotaktycznego podczas dotykania bregmy - jest to punkt odniesienia dla współrzędnych.
- Zmontuj zestaw słuchawkowy, wkładając wszystkie elektrody do sześciopinowego cokołu, upewniając się, że kołki są wciśnięte do końca. Zamontuj cokół w uchwycie elektrody na ramie stereotaktycznej (Rysunek 1B).
- Ustaw elektrody nad odpowiednimi otworami na zadziory. Stereotaktycznie wszczepij skręcone bipolarne elektrody druciane ze stali nierdzewnej w prawym i lewym hipokampie oraz elektrodę odniesienia do móżdżku, powoli opuszczając zestaw słuchawkowy i prowadząc elektrody do otworów w zadziorach.
- Gdy elektroda skrętna hipokampa znajdzie się tuż nad otworem, wyzeruj oś Z i powoli opuść do -3,0 mm.
- Pokryj powierzchnię czaszki i elektrody cementem dentystycznym i wypełnij przestrzeń między powierzchnią czaszki a dnem cokołu. Krawędzie skóry będą przylegać do cementu dentystycznego, tak że żadna tkanka pod spodem nie pozostanie odsłonięta. Poczekaj, aż cement wyschnie i stwardnieje. Następnie odłącz uchwyt elektrody od ramienia stereotaktycznego i zdejmij uchwyt z cokołu.
- Wstrzyknąć 0,1 ml ketoprofenu (1 mg/ml, podskórnie [SC]) w celu znieczulenia i drugą dawkę 0,5 ml normozolu (SC) w celu nawodnienia i usunąć zwierzę z ramy stereotaktycznej.
- Umieścić podkładkę izotermiczną podgrzaną do temperatury 37 °C w pustej klatce wiwarium przykrytej ręcznikiem papierowym. Gdy zwierzę jest w pełni wybudzone, umieść je w czystej klatce z pościelą i miękkim jedzeniem, a następnie zwróć je do wiwarium. Od tego momentu zwierzęta są trzymane pojedynczo, aby zapobiec gryzieniu nawzajem swoich zestawów słuchawkowych. Zbiorniki z drucianymi prętami nie są używane, aby uniknąć utknięcia zestawów słuchawkowych, a zamiast tego butelki z wodą są przywiązane do spodu górnych części klatki, a karma jest obecna w pościeli.
- Karm zwierzę miękkim pokarmem przez 72 godziny po operacji i monitoruj utratę wagi i ocenę kondycji ciała. Odwodnionym zwierzętom można podawać podskórnie 0,5 ml normozolu, jeśli są odwodnione (utrata masy ciała, zwiększony turgor skóry, zapadnięte oczy). Ketoprofen można podawać podskórnie raz dziennie przez kolejne 2 dni po zabiegu (postępuj zgodnie ze schematem analgezji zgodnie z wytycznymi lokalnego instytucjonalnego komitetu ds. opieki i użytkowania zwierząt [IACUC]). Pozwól zwierzętom w pełni wyzdrowieć w klatkach przez 4-7 dni przed przeniesieniem do systemu rejestracji elektroencefalografii (EEG).
