Opisano protokół obrazowania in vivo służący do monitorowania pierwotnych aksonów sensorycznych po zmiażdżeniu korzenia grzbietowego. Procedury te wykorzystują fluorescencyjną mikroskopię szerokopolową oraz myszy transgeniczne thy1-YFP i umożliwiają wielokrotne obrazowanie regeneracji aksonów na odcinku 4 cm w obwodowym układzie nerwowym (PNS) oraz oddziaływań aksonów z granicą ośrodkowego układu nerwowego (CNS).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie na żywo aksonów korzeni grzbietowych po ryzotomii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pierwotne aksony sensoryczne uszkodzone w wyniku urazów korzeni rdzeniowych nie regenerują się w rdzeniu kręgowym, co prowadzi do przewlekłego bólu i trwałej utraty czucia. Regeneracja aksonów korzenia grzbietowego (DR) w rdzeniu kręgowym jest blokowana w strefie wejścia korzenia grzbietowego (DREZ), która stanowi interface między OUN a OUNobwodowym. Nasza wiedza na temat molekularnych i komórkowych zdarzeń uniemożliwiających regenerację w DREZ jest niepełna, częściowo dlatego, że złożone zmiany związane z urazem nerwu wnioskowano z analiz pośmiertnych. Dynamiczne procesy komórkowe, takie jak regeneracja aksonów, najlepiej badać za pomocą technik rejestrujących zdarzenia w czasie rzeczywistym poprzez wielokrotne obserwacje każdego żywego zwierzęcia. Nasza zdolność do seryjnego monitorowania neuronów in vivo wzrosła gwałtownie dzięki rewolucyjnym innowacjom w optyce i transgenice myszy. Kilka linii transgenicznych myszy thy1-GFP, w których podgrupy neuronów są genetycznie znakowane odrębnymi kolorami fluorescencyjnymi, pozwala na obrazowanie pojedynczych neuronów in vivo1. Myszy te były szeroko wykorzystywane do obrazowania in vivo mięśni2-4 i mózgu5-7, dostarczając nowych informacji o mechanizmach fizjologicznych, których analizy statyczne nie były w stanie wyjaśnić. Badania obrazowe neuronów w żywym rdzeniu kręgowym rozpoczęły się dopiero niedawno. Lichtman i jego współpracownicy po raz pierwszy wykazali ich wykonalność, śledząc uszkodzone aksony słupów tylnych (DC) za pomocą mikroskopii szerokopolowej8,9. Osiągnięto również wielofotonowe obrazowanie in vivo głęboko położonych aksonów DC, mikrogleju i naczyń krwionośnych10. W ciągu ostatnich kilku lat zapoczątkowaliśmy stosowanie obrazowania in vivo do monitorowania regeneracji aksonów DR z wykorzystaniem mikroskopii szerokopolowej i linii myszy thy1-YFP H. Badania te doprowadziły nas do nowej hipotezy dotyczącej przyczyn, dla których regeneracja aksonów DR w obrębie rdzenia kręgowego jest blokowana11.
W linii myszy thy1-YFP z linii H poszczególne aksony YFP+ są rozmieszczone powierzchownie, co pozwala na jednoczesne monitorowanie kilku aksonów. Ustaliliśmy, że aksony DR docierające do DREZ są lepiej widoczne w obrazowaniu w odcinku lędźwiowym niż w szyjnym rdzenia kręgowego. W niniejszym raporcie opisujemy kilka strategii, które okazały się użyteczne w celu zapewnienia skutecznego, długoterminowego i powtarzalnego obrazowania regenerujących się aksonów DR. Obejmują one metody eliminujące konieczność wielokrotnej intubacji i przerywania oddychania, minimalizujące stres związany z operacją oraz tworzenie blizn, a także pozwalające na uzyskanie stabilnych obrazów o wysokiej rozdzielczości bez wywoływania fototoksyczności.
Protokół
1. Konfiguracja mikroskopu i przygotowanie do obrazowania
- Nasz zestaw do obrazowania składa się z fluorescencyjnego stereomikroskopu Leica MZ16 z szybką migawką oraz chłodzonej kamery CCD sterowanej oprogramowaniem Metamorph.
- Przygotować termostatycznie sterowaną matę grzewczą i ustawić moc tak, aby utrzymać temperaturę 32.5°C w celu zachowania temperatury ciała zwierzęcia podczas i po operacji.
- Sterylny roztwór Ringera lub sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) należy wcześniej podgrzać do 32.5°C w celu nawadniania rdzenia kręgowego podczas operacji.
- Zwierzę należy znieczulić poprzez dostrykanię dootrzewnowe mieszaniny ksylazyny (8 mg/kg) i ketaminy (120 mg/kg).
- Górną część grzbietu należy ogolić trymerem do małych zwierząt, a następnie za pomocą patyczków z watą rozprowadzić jedną małą kroplę kremu do depilacji na ogolonym obszarze. Po kilku minutach nałożony krem należy usunąć za pomocą gazy nasączonej 70% etanolem.
2. Laminektomia i chirurgiczne odsłonięcie korzenia grzbietowego L5
- Umieść zwierzę na podgrzewanej (32,5° C) podkładce i zdezynfekuj skórę tamponami nasączonymi 70% etanolem.
- Przy użyciu oświetlenia w polu jasnym w stereomikroskopie wykonaj nacięcie w linii środkowej (2-3 cm) na skórze grzbietu. W razie potrzeby użyj tamponów z bawełnianym końcem, aby zatamować krwawienie.
- Odchyl mięśnie grzbietu, aby odsłonić leżące pod nimi kręgi lędźwiowe.
- Odsłoń segmenty rdzenia kręgowego L3-S1, wykonując prawostronną hemilaminektomię za pomocą małych kleszczyków kostnych. Częściową laminektomię odsłaniającą 4-6 segmentów odcinka lędźwiowego i krzyżowego rdzenia kręgowego wykonuje się poprzez usunięcie prawej części grzbietowej kręgu L5 na poziomie grzebienia biodrowego (lokalizacja zwoju korzeniowego tylnego DRG L5) w kierunku rostralnym aż do kręgu L2 (2 kręgi za ostatnim żebrem). Przepłucz jamę ciepłym, sterylnym roztworem Ringera.
- Ustaw zwierzę na poduszce wspierającej (zrolowana gaza bawełniana), aby spłaszczyć kręgosłup. Użyj haków do retrakcji, aby poszerzyć odsłonięty obszar.
- W tym momencie (około 30 minut po pierwszej iniekcji znieczulenia i.p.) należy podać dawkę uzupełniającą (0,5X) podskórnie, aby utrzymać pełną narkozę zwierzęcia. Alternatywnie, podczas sesji obrazowania trwających dłużej niż 1 godzina, można zastosować znieczulenie gazowe (2-4% izofluranu w 0,5L/min tlenu) w celu ponownego znieczulenia.
3. Rizotomia/Zgniecenie korzenia grzbietowego
- Przełącz na wzbudzenie fluorescencyjne, aby zwizualizować aksony (+) znakowane YFP.
- Za pomocą czubka igły podskórnej (26ga.) wykonaj niewielkie nacięcie opony twardej nad tylnym korzeniem (DR) L5. Wielokrotnie przepłucz roztworem Ringera i delikatnie oczyść za pomocą tamponów watnych.
- Zidentyfikuj miejsce do zmiażdżenia i wprowadź jedną stronę precyzyjnej pęsety (Dumont #5) podoponowo.
- Zaciśnij pęsetę delikatnie, lecz pewnie, chwytając przyśrodkową część korzenia L5 na 10 sekund, a następnie delikatnie otwórz pęsetę.
- Wielokrotnie przemyj roztworem fizjologicznym i delikatnie oczyść za pomocą tamponów watnych.
4. Pozyskiwanie obrazów i procedury pooperacyjne
- Należy wykonać kilka obrazów całego odsłoniętego obszaru, w tym miejsca zmiażdżenia oraz DREZ, przed i bezpośrednio po zmiażdżeniu, zarówno przy małym, jak i dużym powiększeniu.
- Obrazy są pozyskiwane jako pojedyncze migawki lub jako wielokrotne strumienie od 10 do 20 klatek przy czasie ekspozycji od 30 do 40 ms. Następnie wybiera się obrazy ostre, a później, przy użyciu programu Photoshop, tworzy się montaż ogólny.
- Aby zminimalizować powstawanie blizn, na odsłonięty rdzeń kręgowy należy ściśle nałożyć fragment cienkiej syntetycznej membrany macierzy (Biobrane), a następnie sztuczną oponę twardą. Należy upewnić się, że fragmenty są docięte tak, aby dokładnie pasowały do okna odsłoniętego rdzenia kręgowego i przylegały do niego.
- Mięśnie zamyka się sterylnymi szwami 5-0, a nacięcie w linii środkowej zamyka się klamrami do ran.
- Należy wstrzyknąć roztwór Ringera (0,3–0,5 mL podskórnie) oraz podać buprenorfinę jako lek przeciwbólowy pooperacyjny (0,05 mg/kg) podskórnie co 12 h przez 2 dni.
- Zwierzę należy utrzymywać na podgrzewaczce (34°–35° C) aż do pełnego wybudzenia.
5. Obrazowanie powtórzone
- Zanurzyć zwierzę w znieczuleniu i usunąć klamry oraz szwy z rany.
- Usunąć sztuczną oponę twardą oraz cienkie łaty z syntetycznej membrany macierzy i umieścić je w sterylnej probówce z roztworem Ringera w celu późniejszego ponownego użycia.
- Ostrożnie usunąć nagromadzoną bliznę z tkanki łącznej za pomocą igły podskórnej z zakrzywioną końcówką oraz precyzyjnej pęsety. Często przepłukiwać ciepłym roztworem Ringera.
- Ponownie odsłonić pole operacyjne, w tym miejsce zmiażdżenia i DREZ, zlokalizować aksony YFP+ obrazowane w poprzednich sesjach i powtórzyć procedury opisane w sekcji 4.
6. Reprezentatywne wyniki:
Zaobserwowaliśmy, że podczas gdy aksony te nie regenerowały się po urazie w wyniku przecięcia, prawie wszystkie aksony YFP+ odrosły przez miejsce urazu w ciągu 3 dni po zmiażdżeniu (Rysunek 1)11. Typowo, dzień po zmiażdżeniu obserwowaliśmy degenerację wsteczną aksonów w kikutcie proksymalnym oraz fragmentację/degenerację tych samych aksonów dystalnie względem miejsca zmiażdżenia, co potwierdziło, że aksony zostały odpowiednio uszkodzone (np. Rysunek 1; Dzień 3 i 5). Zastosowano kilka dodatkowych kryteriów, aby jednoznacznie odróżnić aksony regenerujące od aksonów, które zostały oszczędzone lub powróciły do stanu poprzedniego po urazie. Obejmowały one następujące cechy: (1) aksony regenerujące wykazują poszerzenie niefluorescencyjnej części aksonu YFP+ w miejscu zmiażdżenia z powodu degeneracji proksymalnej i dystalnej (w przeciwieństwie do zwężenia nieoznaczonej przerwy spowodowanego wypełnieniem miejsca zmiażdżenia fluorescencyjną cytoplazmą w przypadku, gdy aksony przeżyły uraz); (2) aksony regenerujące są znacznie cieńsze, wykazują słabszą fluorescencję i są bardziej pofalowane niż aksony, które przeżyły uraz; (3) regenerujące neuryty są cieńsze i słabiej fluorescencyjne niż degenerujące fragmenty fluorescencyjne aksonów, przez które one wrastały; (4) w przeciwieństwie do aksonów przeżywających lub oszczędzonych, aksony regenerujące zatrzymują się na poziomie DREZ; oraz (5) w przeciwieństwie do aksonów przeżywających lub oszczędzonych, aksony regenerujące nie wykazują obecności węzłów Ranviera. Rysunek 1 przedstawia cztery powierzchowne aksony YFP+ bezpośrednio po zmiażdżeniu (A1; kolorowe strzałki). Trzy dni po zmiażdżeniu wszystkie cztery aksony emitują pojedynczy neuryt, który wrasta przez miejsce zmiażdżenia (A2). Pięć dni po zmiażdżeniu neuryty pozostają stabilne i nie obserwuje się dalszego wzrostu tych lub innych aksonów proksymalnych (A3).
Regenerujące neuryty, które przekroczyły miejsce zmiażdżenia, wydłużały się poprzez znacznie grubsze i jaśniejsze fluorescencyjne fragmenty degenerującego aksonu (tj. rurki endoneurialne) i docierały do DREZ już 4 dni po zmiażdżeniu (około 3mm/2 dni)11. Powtarzalne obrazowanie tych aksonów i ich zakończeń co dwa lub trzy dni przez kolejne dwa tygodnie (Rycina 2) wykazało, że nie rosły one do przodu ani się nie cofały, lecz pozostawały nieruchome. Jedyną zauważalną zmianą było obrzęknięcie zakończeń i trzonów niektórych aksonów. Obserwacje te wykazują zatem zaskakująco szybką i przewlekłą immobilizację regenerujących aksonów w obrębie DREZ.
Rysunek 1: Powtarzalne obrazowanie aksonów YFP+ w zwoju korzeniowym tylnym L5 w miejscu zmiażdżenia korzenia tylnego w ciągu 5 dni. Przyśrodkowa część korzenia L5 została zmiażdżona (czerwony grot strzałki) i obrazowana w dniach 0, 3 i 5 po urazie. Obszar zmiażdżenia został powiększony w panelach po prawej stronie (A1-A3).
Rysunek 2: Powtarzalne obrazowanie aksonów docierających do DREZ w ciągu 20 dni po zmiażdżeniu korzenia L5. Dzień 4, trzy aksony (kolorowe strzałki) dotarły do DREZ. Końcówki tych aksonów pozostają w tym samym miejscu i mają podobny wygląd w kolejnych sesjach obrazowania w dniach 7, 9, 13, 15 oraz 20. Pozycje końcówki aksonu względem innych końcówek aksonów i punktów orientacyjnych (gwiazdki) zostały wykorzystane do określenia ruchliwości aksonów pomiędzy sesjami obrazowania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obrazowanie regeneracji DR bezpośrednio u żywych myszy jest szczególnie trudne, ponieważ wymaga rozległej laminektomii grzbietowej w celu monitorowania wzrostu aksonów na szerokim obszarze, a następnie wielokrotnych inwazyjnych procedur chirurgicznych i anestezjologicznych podczas kolejnych sesji obrazowania. Kilka strategii pomogło przezwyciężyć te trudności. Po pierwsze, skuteczne obrazowanie wymagało zmniejszenia śmiertelności myszy (około 25%) poprzez minimalizację czasu trwania znieczulenia i krwawienia oraz dzięki ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr Alanowi Tesslerowi za uwagi i pomoc redakcyjną. Praca była finansowana przez NIH NS062320.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| linia H thy1-YFP (wiek 2–4 miesiące, obie płcie) | Jackson Laboratory | 003782 | |
| Ksylazyna (AnaSed injection, roztwór sterylny) | Lloyd, Inc. | 4811 | 8 mg/kg |
| Ketamina (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira Inc. | 2051 | 120 mg/kg |
| Buprenorfina (Buprenex w formie zastrzyku) (0,05 mg/kg) | Reckitt Benckiser | 7571 | |
| Maszynka do strzyżenia włosów małych zwierząt | Oster Professional Products | 76059-030 | |
| Krem do depilacji | Church & Dwight Co. | NAIR z olejką dla niemowląt | |
| Tampony gazowe | Fisher Scientific | 22-362-173 | |
| Patyczki z bawełnianym złowogiem | Fisher Scientific | 14-960-3Q | |
| strzykawki 1 ml | BD Biosciences | 309602 | |
| Igły do iniekcji podskórnych (Sub-Q), 26ga. | BD Biosciences | 305115 | |
| Nożyczki sprężynowe i pęsety | Fine Science Tools | ||
| zakrzywione kuretażowe kleszcze do kości 2,5 mm | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| roztwór Ringera z mleczanem’wstrzykiwanie USP | B. Braun Medical | BBR-L7502 | |
| Sterylny roztwór soli fizjologicznej | APP Pharmaceuticals | 918610 | |
| Cienka syntetyczna membrana macierzowa (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals | 62794-096-251 | |
| Sztuczna opona twarda | Sztuczna zastawka Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates | 1MVP40 | |
| szwy jedwabne 5-0 | Ethicon Inc. | K-580 | |
| Klamry do ran | Perfect - Ets Bruneau, (Burnea, Francja) | A75 | |
| Fluorescencyjny stereomikroskop | Leica Microsystems | MZ16 | |
| kamera CCD | Hamamatsu Corp. | ORCA-Rx2 | |
| Regulator temperatury | World Precision Instruments, Inc. | ATC 1000 | |
| Oprogramowanie Metamorph | Molecular Devices | ||
| Photoshop | Adobe |
Bibliografia
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
- Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
- Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Maio, D. D. i in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
