Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Zwierzęta
- W tym badaniu wykorzystaj samce i samice szczurów w wieku 3 miesięcy.
- Trzymaj zwierzęta w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody.
2. Przygotowanie koktajlu KAX (ketamina + ksylazyna + acepromazyna) do znieczulenia zwierząt
- Rozpuścić 50 mg ksylazyny (20 mg/ml) w 5 ml ketaminy (100 mg/ml) z 1 ml acepromazyny (10 mg/ml) i 3 ml wody destylowanej. Dokładnie wymieszaj.
- Wysterylizować filtrem strzykawkowym i przechowywać ten roztwór w butelce z surowicą o pojemności 10 ml.
3. Wtrysk KAX
- Zważyć zwierzę (g) i umieścić je w klatce do momentu, gdy będzie gotowe do wstrzyknięcia.
- Wstrzyknąć dootrzewnowo 0,1 ml KAX/100 g masy ciała zwierzęcia za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą 28 G.
- Pozwól, aby zwierzę straciło przytomność. Sprawdź odruchy, szczypiąc stopy i ogon.
- Trzymaj wszystkie zwierzęta bezpiecznie w laboratorium na czas operacji.
- Po operacji umieść zwierzęta w klatkach i utrzymuj je w komfortowej temperaturze pokojowej (RT) do czasu odzyskania przytomności. Zwierzęta należy zwracać do obiektu tylko wtedy, gdy się obudzą i wznowią normalne zachowanie.
4. Przygotowanie do operacji i montażu mikroigieł
- Przygotować sterylny 2 M roztwór NaCl.
- Za pomocą ściągacza do mikroelektrod (Rysunek 1C) wciągnij jedną grubościenną, polerowaną, standardową i cienkościenną rurkę borokrzemianową o średnicy wewnętrznej 0,86 mm do dwóch drobno zwężających się szklanych mikroigieł (Rysunek 1D, Rysunek 1E).
- Napełnij jedną mikroigłę z poprzedniego etapu 2 M solą fizjologiczną za pomocą igły do zasypywania strzykawki i strzykawki o pojemności 1 ml (Rysunek 1B). Wystuknij pęcherzyki powietrza z końcówki elektrody.
- Napełnić drugą strzykawkę o pojemności 1 ml 2 M NaCl. Podłącz igłę 18 G, a następnie przymocuj rurkę polietylenową na długość (około 10 cali) (Rysunek 1A). Za pomocą tłoka strzykawki napełnić rurkę polietylenową solą fizjologiczną przez igłę.
- Gdy zarówno mikroigła, jak i rurka zostaną wypełnione solą fizjologiczną, ostrożnie je połącz. Wyeliminuj powietrze z połączenia między nimi (Rysunek 2).
- Drobno ukosuj końcówkę mikroigły, zeskrobując ją bardzo delikatnie o słoje ręcznika papierowego.
- Sprawdź opór mikroigły, delikatnie naciskając tłok na strzykawce, aż na ręczniku papierowym będzie widoczny drobny strumień płynu. Strumień cieczy nie powinien być szerszy niż 0,5 mm.
5. Przygotowanie zwierzęcia
- Nałóż 1-2 krople znieczulenia miejscowego na rogówkę (roztwór okulistyczny chlorowodorku proparakainy, USP, 0,5%). Poczekaj, aż nie wystąpi odruch oczny.
- Przytnij wąsy nożyczkami.
- Nasącz aplikator z bawełnianą końcówką roztworem betadyny i wymazówką wokół oka eksperymentalnego.
- Za pomocą mikroskopu przymocuj hemostat, aby zacisnąć dolną powiekę, aby wybrzuszyć oko, odsłonić żyłę nadtwardówkową i ograniczyć ruchy gałek ocznych. (Rysunek 3, grot strzałki)
6. Wstrzyknięcie soli fizjologicznej wywołującej jaskrę
- Po przygotowaniu zespołu mikroigłowego i zwierzęcia należy rozpocząć wstrzykiwania.
- Gdy potwierdzi się, że zwierzę nie reaguje na szczypanie stóp/ogona, ostrożnie przebij żyłę nadtwardówkową mikroigłą, zbliżając się pod małym kątem od 10 do 20 stopni do żyły (ryc. 3, biała strzałka). Udane wkłucie do żyły jest widoczne, gdy krew dostanie się do końcówki mikroigły (ryc. 3, strzałka).
- Powoli i ręcznie wstrzyknąć do żyły około 50 μl soli fizjologicznej. Powinno to zająć około 10 sekund. Żyły bledną na biało, gdy sól krąży w układzie naczyniowym (ryc. 4, grot strzałki). Niektóre obszary mogą zachować krwistoczerwony wygląd (Ryc. 4, strzałka).
- Wykonać drugie wstrzyknięcie do żyły, naprzeciwko miejsca pierwszego, aby zapewnić dokładne uszkodzenie siatkówki w całej warstwie komórek zwojowych siatkówki.
Uwaga: W ciągu kilku minut powinno pojawić się wyraźne zmętnienie przez tęczówkę oka, gdy sól krąży w układzie naczyniowym.
- Przeciwległe oko należy pozostawić nieleczone do stosowania jako kontrola wewnętrzna.
