Ocena żywotności neuronów w hodowli neuronów móżdżku za pomocą podwójnego barwienia

Streszczenie

Źródło: Jiajia, L., et al. Ocena żywotności neuronów za pomocą podwójnego barwienia dioctanu fluoresceiny i jodku propidium w hodowli neuronów ziarnistych móżdżku. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film demonstruje metodę identyfikacji neuronów z mieszanej kultury ziarnistych neuronów móżdżku i komórek glejowych za pomocą podwójnego barwienia dioctanem fluoresceiny (FDA) i jodkiem propidyny (PI), gdzie żywe neurony wydają się zielone, a martwe neurony czerwone.

Protokół

1. Podwójne barwienie FDA-PI i hodowla neuronów ziarnistych móżdżku (CGN)

1. Przygotować roztwór roboczy dioctanu fluoresceiny i jodku propydyny (FDA-PI), dodając 20 μl roztworu podstawowego FDA (stężenie końcowe: 10 μg/ml) i 50 μl roztworu podstawowego PI (stężenie końcowe: 50 μg/ml) w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wymieszaj przez wirowanie i umieść to na lodzie.
   nuta: Świeżo przygotuj roztwór roboczy FDA-PI tuż przed użyciem.
2. Wyjąć płytkę do hodowli komórkowej z inkubatora. Połóż go na lodzie.
3. Odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić ją zimnym PBS.
   nuta: Zmiana roztworu musi być wykonywana powoli i ostrożnie. Unikaj dotykania komórek końcówkami pipet.
4. Odessać zimny PBS i zastąpić go zimnym FDA-PI (500 μl/dołek dla 12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych lub 1 ml/dołek dla 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych). Pozostaw na lodzie na 5 minut.
5. Odessać FDA-PI i dodać zimny PBS (100 μl/dołek dla 12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych lub 50 μl/dołek dla 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych).
   nuta: Nie należy dopuścić do wyschnięcia komórek podczas robienia zdjęć.
6. Rób zdjęcia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Stosować filtr wzbudzenia o paśmie przepustowym 450 - 490 nm. Wykrywanie emisji fluorescencji dla FDA i PI odpowiednio przy 520 i 620 nm. W tych samych warunkach wykonaj zdjęcie w normalnym świetle, korzystając z trybu kontrastu fazowego mikroskopii fluorescencyjnej.
   nuta: Rób zdjęcia w ciągu 15 minut po FDA-PI. Czas naświetlania wynosi 100-300 ms, a wzmocnienie analogowe 2,8x.

2. Ocena żywotności neuronów

1. W przypadku podwójnego barwienia FDA-PI nałóż obrazy komórek wykrytych po przefiltrowaniu przez różne filtry fluorescencyjne, przeciągając warstwę dodatnią FDA na warstwę dodatnią PI w oprogramowaniu edytora graficznego.
   1. Dostosuj krycie warstwy dodatniej FDA, wpisując "50%" w polu "Krycie" panelu "Warstwy". Połącz dwie warstwy, klikając przycisk "Scal widoczne" w menu "Warstwa". Ustaw kontrast obrazów nakładki, wpisując "50" w polu "Kontrast" w sekcji "Obraz"| "Korekty" | "Jasność/Kontrast". Upewnij się, że na obrazach nakładki nie ma podwójnie dodatnich komórek FDA i PI.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Surowica bydlęca płodu	Gibco (firma Gibco)	10099141	wysoka jakość FBS ma zasadnicze znaczenie dla kultury
100× glutamina	Gibco (firma Gibco)	25030081
100× antybiotyk	Gibco (firma Gibco)	15240062
BME średni	Gibco (firma Gibco)	21010046
Dioctan fluoresceiny	Sigma	Zobacz materiał F7378
Jodek propidyny	Sigma	Zobacz materiał P4170
Królicze przeciwciało anty-GAP43	Księga Abcam	ab75810
Mysie przeciwciało anty-GFAP	Sygnalizacja komórkowa	3670
Pipeta Pasteura	Wolak	Z310727	Spal końcówkę przed użyciem
6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych	TPP (TPP)	Z707759	Wysokiej jakości płytka do hodowli komórkowej jest niezbędna do hodowli
filtr	Milipory	SLGP033RB
Pipeta 5 ml	Excell Bio	Przekaźnik CS017-0003
Pipeta 10 ml	Excell Bio	Przekaźnik CS017-0004
Inkubator CO2	Thermo Scientific	Rozdział 311
Mikroskop fluorescencyjny	Nikon	TI-S
Filtr fluorescencyjny i kostki emisyjne	Nikon	B-2A, G-2A, UV-2A
Oprogramowanie fotograficzne	Nikon	Elementy NIS
Edytor graficzny softeware	Adobe	Photoshop CS
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu	Nih	ObrazJ

powiedział: szt.