Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Przygotowanie i hodowla plastrów organotypowych hipokampa
UWAGA: Ten protokół pozwala na produkcję organotypowych plastrów hipokampa. Idealnie byłoby, gdyby nie więcej niż trzy zwierzęta zostały poddane eutanazji i sekcji podczas jednej sesji, aby upewnić się, że każdy krok zostanie wykonany szybko i uniknąć pogorszenia jakości plastrów. Przez cały czas stosuj technikę aseptyczną.
- Upewnij się, że przed rozpoczęciem protokołu sekcji podjęto następujące kroki.
- Przygotuj i przefiltruj wszystkie roztwory z wyprzedzeniem za pomocą filtra 0,22 μm.
- Roztwory należy utrzymywać w temperaturze 4 °C podczas przechowywania oraz podczas preparowania mózgu i przygotowywania plastrów hipokampa, trzymając pojemniki do przechowywania i szalki Petriego na metalowym radiatorze przez cały czas na mokrym lodzie.
- Autoklaw wszystkie metalowe instrumenty, pierścienie i chusteczki papierowe.
- Upewnij się, że wszystkie instrumenty i materiały, które mają być użyte na każdym etapie protokołu, są gotowe do użycia, ułożone z wyprzedzeniem i spryskane 70% etanolem. Następnie pozwól im ostygnąć i wyschnąć.
- Poddaj eutanazji 5-7-dniowe szczenię myszy C57BL/6N przez zwichnięcie szyjki macicy i krótko przetrzyj całą powierzchnię skóry sterylną chusteczką papierową nasączoną 70% etanolem. Osusz skórę i odetnij głowę szczeniakowi za pomocą nożyczek Mayo.
- Przetnij skórę głowy nożyczkami do tęczówki wzdłuż linii środkowej głowy, zaczynając w okolicy potylicznej, a kończąc w pobliżu pyska, a następnie cofnij ją na boki.
- Włóż końcówkę nożyczek Vannas w otwór wielki i wykonaj dwa małe boczne nacięcia na kości wzdłuż zatok poprzecznych, a następnie przetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej aż do opuszki węchowej i wykonaj dwa małe nacięcia prostopadle do linii środkowej w tym obszarze.
- Używając zakrzywionych kleszczyków z cienkimi punktami, cofnij płaty kości na boki od linii środkowej. Ostrożnie wyjąć mózg małą szpatułką i przenieść go na pokrytą elastomerem silikonowym o średnicy 90 mm szalkę Petriego zawierającą "podłoże preparacyjne"
nuta: Pożywką preparacyjną jest zbilansowany roztwór soli Geya (5 mg/ml D-glukozy, 1% roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, 10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 mg/ml streptomycyny i 25 μg/ml amfoterycyny B).
- Usuń móżdżek i oddziel półkule mózgowe wzdłuż linii środkowej za pomocą żyletki. Za pomocą szpatułki przenieś półkule mózgowe na nową, pokrytą elastomerem silikonowym płytkę Petriego o średnicy 90 mm, wypełnioną świeżym, lodowatym podłożem do preparacji. Jeśli w jednej sesji ma być wykorzystane więcej niż jedno zwierzę, powtórz kroki 1.2–1.6.
- Pod mikroskopem stereoskopowym przeciąć opuszkę węchową i czubek kory czołowej żyletką i oddzielić korę mózgową od reszty tkanki mózgowej za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Ten krok pozostawia hipokamp odsłonięty na przyśrodkowej powierzchni tkanki korowej. Począwszy od tego etapu, należy używać kaptura do hodowli tkanek z przepływem laminarnym (sterylizowanego ultrafioletem i czyszczonego 70% roztworem etanolu).
- Nałóż lodowato zimne podłoże preparacyjne na płaską plastikową tarczę do krojenia i za pomocą szpatułki ustaw tkankę mózgową na dysku tak, aby przyśrodkowa powierzchnia kory była skierowana do góry, a oś hipokampa była prostopadła do osi ostrza do siekania.
- Usuń pożywkę preparacyjną z tarczy do siekania tak bardzo, jak to możliwe, za pomocą pipety Pasteura z cienką końcówką.
- Pokrój mózg na plastry o grubości 400 μm za pomocą rozdrabniacza do tkanek z prędkością i siłą rozdrabniania 50%.
nuta: Ten etap musi zostać wykonany tak szybko, jak to możliwe, ponieważ tkanka mózgowa nie jest zanurzona w pożywce preparcyjnej .
- Zastąp pożywkę do preparacji na szalce Petriego pokrytej elastomerem silikonowym świeżą, lodowatą pożywką.
- Po zakończeniu rozdrabniania tkanek ostrożnie zanurz tkankę mózgową w świeżym podłożu preparacyjnym i przenieś przeciętą tkankę z powrotem na 90-milimetrową szalkę Petriego pokrytą elastomerem silikonowym za pomocą skalpela o prostym ostrzu.
- Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie oddziel plastry kory mózgowej za pomocą kleszczyków z cienką końcówką. Dla każdego plasterka sprawdź hipokamp pod kątem morfologii i potencjalnych uszkodzeń tkanek wynikających z rozcięcia lub krojenia.
- Oddziel hipokampy od kory śródwęchowej i od fimbrii za pomocą kleszczy z cienką końcówką i małych nożyczek Vannas. Zazwyczaj na półkulę generowanych jest około 6 do 8 wycinków hipokampa.
- Przenieś do 6 wycinków hipokampa do wkładki do hodowli tkankowej za pomocą pociętej pipety Pasteura i umieść ją na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Upewnij się, że plasterki są rozłożone w odległości kilku milimetrów od siebie (zapewni to, że każdy plasterek będzie mógł być obrazowany indywidualnie).
- Natychmiast dodaj lodowatą "pożywkę wzrostową" na dno każdej szalki Petriego, pod wkładką do hodowli tkankowej, tuż poniżej górnej krawędzi wkładki do hodowli tkankowej.
nuta: Pożywka wzrostowa zawiera 50% minimum niezbędnego podłoża Eagle, 25% zbilansowanego roztworu soli Hanksa, 25% surowicy końskiej, 5 mg/ml D-glukozy, 2 mmol/l L-glutaminy, 1% roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego i 10 mmol/L kwasu HEPES(4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego), miareczkowanego do pH 7,2 wodorotlenkiem sodu.
- Zmienić pożywkę następnego dnia po rozbiorze, a następnie co 2 do 3 dni (użyć pożywki wzrostowej w temperaturze 37 °C). Upewnij się, że pożywka wzrostowa jest dodana wystarczająco, ale nie na tyle, aby przelała się przez błonę wkładki do hodowli tkankowej, co mogłoby zagrozić żywotności wycinków tkanki.
- Przed użyciem w eksperymentach plastry tkanek należy przechowywać w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla w powietrzu przez 12 do 14 dni.
2. Przygotowanie wycinków organotypowych hipokampa do eksperymentalnego protokołu TBI Blast
UWAGA: Etapy tej sekcji, z wyjątkiem obrazowania, odbywają się w kapturze do hodowli tkanek z przepływem laminarnym.
- Włóż wykonane na zamówienie pierścienie ze stali nierdzewnej do płytki 6-dołkowej (po jednym na dołek).
UWAGI: Pierścienie mają obręcz z wycięciem (które powinno znajdować się w pozycji godziny 12) i ściśle przylegają do studzienek, podczas gdy wkładki do hodowli tkankowych łatwo mieszczą się w tej obręczy. Upewnij się, że pierścienie zostały umyte bakteriobójczym środkiem dezynfekującym, dokładnie spłukane oczyszczoną wodą, autoklawowane i pozostawione do wcześniejszego ostygnięcia.
- Napełnić studzienkę 6-dołkowej płytki wstępnie podgrzanym (37 °C) "eksperymentalnym podłożem" bez surowicy z jodkiem propidyny.
nuta: Pożywka doświadczalna z jodkiem propydyny to 75% Minimum niezbędne podłoże Eagle, 25% zrównoważony roztwór soli Hanksa, 5 mg/ml D-glukozy, 2 mmol/L L-glutamina, 1% roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, 10 mmol/L HEPES i 4,5 μmol/L jodku propidy, miareczkowany pH do 7,2 wodorotlenkiem sodu.
- Upewnij się, że średni poziom nie sięga powyżej wycięcia pierścienia. Przenieść 6-dołkową płytkę z pierścieniami z powrotem do inkubatora na 1 godzinę, aby upewnić się, że pożywka ma temperaturę 37 °C bezpośrednio przed przeniesieniem wkładek do kultur tkankowych.
- Przenieść wkładki do kultur tkankowych z plastrami organotypowymi z szalek Petriego o średnicy 35 mm na płytkę 6-dołkową z pierścieniami i pożywką doświadczalną za pomocą kleszczy.
- Zrób kropkę na brzegu wkładki w pozycji godziny 3 za pomocą markera permanentnego.
nuta: Wkładki zostaną usunięte z płytki 6-dołkowej podczas eksperymentu. Ten krok ułatwia powrót wkładki do pierwotnej pozycji po ekspozycji na falę uderzeniową i łatwo śledzi każdy plasterek przez cały protokół.
- Oznacz każdą 6-dołkową płytkę unikalną nazwą i datą oraz sporządź mapę dołków każdej płytki, nazywając każdą studzienkę (np. A, B, C itp.) i każdy plasterek w każdym dołku (np. 1, 2, 3 itd.), tak aby każdy plasterek miał unikalny identyfikator (np. A1, A2, A3 itp.).
- Przenieść 6-dołkową płytkę do inkubatora na 1 godzinę bezpośrednio przed obrazowaniem, aby upewnić się, że plastry mają temperaturę 37 °C.
nuta: Unikaj przelewania się pożywki lub pęcherzyków powietrza pod membraną wkładki do hodowli tkankowej, co mogłoby zagrozić żywotności plastrów.
- 1 godzinę po przeniesieniu do pożywki doświadczalnej należy zobrazować każdą warstwę indywidualnie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (obiektyw 2X, NA 0,06) wyposażonego w odpowiedni filtr wzbudzenia (BP 535/50 nm) i emisyjny (LP 610 nm) w celu oceny stanu warstwy przed przeprowadzeniem protokołu urazu.
Notatki: Plastry, które na tym etapie wykazują obszary gęstego czerwonego zabarwienia, należy uznać za wykazujące zagrożoną żywotność i powinny być wyłączone z dalszej analizy (zazwyczaj stanowią one mniej niż 10% całkowitej liczby wygenerowanych plasterków). Upewnij się, że obrazowanie jest wykonywane sekwencyjnie i tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować czas, w którym plastry znajdują się poza inkubatorem (zazwyczaj obrazowanie 6 dołków powinno zająć nieco poniżej 30 minut).
- Pokrywkę płytki 6-dołkowej należy zawsze założyć. Po wewnętrznej stronie pokrywy może gromadzić się pewna kondensacja. Jeśli tak się stanie, krótko użyj suszarki do włosów na niskim ustawieniu.
- Upewnij się, że wszystkie warunki obrazowania są identyczne w różnych dniach i między eksperymentami.
nuta: Celem obrazowania jest ilościowe określenie fluorescencji tkanek; W związku z tym krok ten jest ważny, aby zapewnić odtwarzalność wyników i umożliwić porównanie danych.
3. Zanurzanie i transport wkładek kultur tkankowych z plastrami organotypowymi hipokampa
- Natychmiast po obrazowaniu, w kapturze z przepływem laminarnym, jedną kulturę tkankową wyjmuje się z płytki 6-dołkowej za pomocą kleszczy.
- Ostrożnie przenieś wkładkę do sterylnego worka polietylenowego (3" x 5") wstępnie wypełnionego 20 ml ciepłego (37 °C) eksperymentalnego podłoża świeżo bąbelkowanego 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla.
nuta: Upewnić się, że pożywka doświadczalna wzbogacona w tlen i dwutlenek węgla była bąbelkowana przez co najmniej 40 minut z 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla za pomocą bełkotki ze spiekanego szkła wewnątrz butelki Dreschel i przeniesiona do sterylnych worków polietylenowych wewnątrz okapu do hodowli tkanek z przepływem laminarnym za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml z filtrem bakteryjnym i dołączoną sterylną rurką do napełniania (127 mm). Natychmiast zszczelnić worki i przenieść je do inkubatora o temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę przed przeniesieniem wkładki do hodowli tkankowej.
- Upewnij się, że każda sterylna torebka jest prawidłowo oznakowana (z tabliczką i identyfikacją studzienki). Powtórz ten krok dla każdej wkładki do hodowli tkankowej. Ostrożnie wyklucz pęcherzyki powietrza po zamknięciu sterylnych torebek (zrób to bezpiecznie, przekręcając górną część worków i nakładając plastikowy zacisk).
- Sterylne worki z wkładkami do kultur tkankowych i 6-dołkowymi płytkami z pożywką doświadczalną należy umieścić z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
- Po upływie 1 godziny ostrożnie zapakuj sterylne worki z wkładkami do kultur tkankowych w plastikowe pudełka wewnątrz termoregulowanego pudełka wypełnionego wodą dejonizowaną o temperaturze 37 °C, aby utrzymać organotypowe plastry w temperaturze fizjologicznej przez cały protokół ekspozycji na falę uderzeniową.
4. Przygotowanie rurki uderzeniowej i ekspozycji na falę uderzeniową z organotypowego plastra hipokampa
- Podczas przygotowywania rurki uderzeniowej i wystawiania na działanie fali uderzeniowej należy nosić buty ochronne ze stalowymi palcami, fartuch laboratoryjny i rękawice.
- Przykręć sterylną ramę uchwytu worka do dystalnego kołnierza rurki amortyzatora, upewniając się, że środkowy otwór jest wyrównany z wylotem rurki amortyzującej (za pomocą pręta zaślepiającego).
- Zamontuj promieniowo dwa przetworniki ciśnienia: czujnik 1 w środkowej części sekcji napędzanej i czujnik 2 w dystalnym kołnierzu rury uderzeniowej (rysunek 1A). Podłącz przetworniki ciśnienia do oscyloskopu za pomocą zasilacza źródła prądu.
- Upewnij się, że wszystkie zawory spustowe rurki uderzeniowej i regulatory przepływu są zamknięte.
- Otwórz zewnętrzny przewód sprężonego powietrza i naładuj zawór elektromagnetyczny do 2,5 bara.
- Otwórz zawór bezpieczeństwa butli ze sprężonym powietrzem i powoli otwórz regulator ciśnienia, aby zwiększyć ciśnienie do około 5 barów.
UWAGA: Ciśnienie ustawione dla tego regulatora powinno być nieco wyższe od najwyższego ciśnienia rozrywającego membrany.
- Przygotuj membrany, tnąc arkusze poliestru o grubości 23 μm na kwadraty o wymiarach 10 x 10 cm2. Przygotuj uchwyty za pomocą taśmy autoklawu i przyklej je do górnej i dolnej części każdej membrany.
- Umieścić jedną membranę (pojedyncza szczelina podwójnego zamka - konfiguracja z pojedynczą membraną) lub dwie membrany (obie szczeliny podwójnego zamka - konfiguracja z podwójną membraną) w zamku (rysunek 1B).
- Wyśrodkuj membrany i zaciśnij je za pomocą czterech i nakrętek M24, mocując je sekwencyjnie w ukośnie symetryczny sposób i upewniając się, że membrany są wolne od zmarszczek.
- Zacisnąć każdą sterylną torbę indywidualnie w pozycji pionowej na ramie uchwytu, upewniając się, że powierzchnia wkładek do hodowli tkankowych z organotypowymi wycinkami hipokampa jest skierowana w stronę wylotu rurki szokowej, a wkładka do hodowli tkankowej jest wyśrodkowana wewnątrz sterylnej torby (rysunek 1C). Upewnij się, że sterylna torba jest bezpiecznie zaciśnięta dookoła, aby zapewnić mocne i równomierne unieruchomienie.
- Nosić ochronniki słuchu i okulary ochronne podczas naciskania na rurkę amortyzującą. Włącz zasilacz źródła prądu i oscyloskop, aby uzyskać dane o fali uderzeniowej (szybkość akwizycji 50 megapróbek/s, długość rekordu 20 ms, 1 milion punktów) i zamknij zawór elektromagnetyczny.
- Za pomocą pokrętła regulacji przepływu na panelu sterowania rurki amortyzatora powoli zwiększaj ciśnienie w sekcji głośności przetwornika rurki amortyzatora w przypadku konfiguracji z pojedynczą membraną lub zarówno w sekcji głośności przetwornika, jak i w sekcji z podwójnym zamkiem rury amortyzatora w przypadku konfiguracji z podwójną membraną.
nuta: W przypadku konfiguracji z pojedynczą membraną ciśnienie rozrywające będzie zależeć tylko od materiału i grubości membrany, a membrana pęknie spontanicznie po osiągnięciu ciśnienia rozrywania materiału. W przypadku konfiguracji z podwójną membraną ciśnienie rozrywające będzie również zależało od różnicy ciśnień gazu zarówno w komorze kierowcy, jak i w podwójnej komorze zamka, a aby membrany pękały w kontrolowany sposób, zawór bezpieczeństwa z podwójnym zamkiem jest otwierany ręcznie po osiągnięciu ciśnienia docelowego.
- Gdy tylko membrana pęknie (wytwarzając głośny dźwięk), szybko zamknij przepływ sprężonego powietrza za pomocą pokrętła przepływu i otwórz zawór elektromagnetyczny.
nuta: Całkowita objętość sekcji sterującej może być modyfikowana przez wstawienie segmentów zaślepiających, co pozwala na uzyskanie szerszego zakresu szczytowego nadciśnienia fali uderzeniowej i czasu trwania. Idealna kombinacja parametrów fali uderzeniowej powinna wystarczyć, aby spowodować uszkodzenie tkanki, ale nie na tyle wysoka, aby spowodować wprowadzenie hodowli tkankowej lub sterylne zniekształcenie lub pęknięcie worka.
- Wystaw każdą sterylną torbę z kulturą tkankową, włóż ją do pojedynczej fali rurki uderzeniowej i natychmiast włóż z powrotem do pudełka z regulacją termiczną, zanim nowy sterylny worek zostanie wyjęty z pudełka i zaciśnięty na ramie uchwytu. Upewnij się, że kroki 4.10–4.14 są wykonywane tak płynnie i szybko, jak to możliwe (w ciągu kilku minut), aby zapobiec wystygnięciu pożywki doświadczalnej, ponieważ temperatury poniżej 37 °C mogą zakłócać rozwój urazu.
- Gdy wszystkie wkładki do kultur tkankowych zostaną wystawione na działanie fali uderzeniowej (lub protokołu pozorowanego), należy je umieścić z powrotem na oryginalnej 6-dołkowej płytce i odpowiednim dołku (wewnątrz okapu do hodowli tkanek z przepływem laminarnym) i powrócić do inkubatora.
- Przechowywać 6-dołkową płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w powietrzu w temperaturze 37 °C do czasu dalszego obrazowania.
- Uwzględnij pozorowane kontrole dla każdego eksperymentu i ekspozycji na falę uderzeniową wycinka.
nuta: Plastry szmatu są traktowane identycznie jak plastry wystawione na działanie fali uderzeniowej (zamknięte w sterylnych workach z pożywką eksperymentalną, transportowane do laboratorium rurki szokowej w tym samym pudełku z regulacją termiczną i zawieszane na metalowej ramie przez równoważny okres czasu), ale rurka szokowa nie jest wypalana.
