Ustalenie modelu choroby Alzheimera w mózgu danio pręgowanego poprzez wstrzyknięcie peptydu amyloidowego

Streszczenie

Bhattarai, P., et al. Modelowanie toksyczności i neurodegeneracji amyloidu-β42 w mózgu dorosłego danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film demonstruje procedurę wstrzykiwania monomerycznych peptydów amyloidowych do przodomózgowia dorosłego danio pręgowanego w celu wytworzenia toksyczności amyloidu, naśladując uszkodzenia neuronów obserwowane w chorobie Alzheimera.

Protokół

1. Przygotowanie peptydu Aβ42

1. Zsyntetyzować peptydy (patrz Tabela 1) przy użyciu standardowej chemii 9-fluorenylu metoksykarbonylu (Fmoc) z 2-(1H-benzotriazolo-1-ylem)-1,1,3,3-tetrametyluronoiumheksafluorfosforanem (HBTU) jako odczynnikiem sprzęgającym w zautomatyzowanym syntezatorze peptydów w fazie stałej. Skala syntezy wynosiła 100 μmol.
2. Załaduj do automatycznego syntezatora peptydów 500 mg żywicy chronionej Fmoc jako fazę stałą (zdolność ładowania 0,2 mmol/g). Załadować rozpuszczone aminokwasy chronione Fmoc w stężeniu 0,5 M w wymaganej objętości i zgodnie z obliczeniami dla odpowiedniego syntezatora.
   nuta: Obliczenia są wykonane tak, aby umożliwić dwukrotne sprzężenie każdego aminokwasu chronionego Fmoc z 5-krotnym nadmiarem każdego elementu budulcowego do żywicy.
3. Rozpuścić odczynniki wymagane do syntezy peptydów w dimetyloformamidzie (DMF). Na przykład należy przygotować aktywator HBTU o stężeniu 0,48 M, 45% v/v N-metylomorfoliny (NMM) (zasada) i 5% v/v bezwodnik octowy (mieszanina zamykająca), aby przykryć nieprzereagowane grupy aminowe.
4. Rozszczepić wszystkie peptydy z żywicy, mieszając w sposób ciągły stałe podłoże za pomocą mieszadła w świeżo przygotowanej mieszaninie rozszczepiającej składającej się z kwasu trifluorooctowego (TFA): triizopropylosilanu (TIS): wody: ditiotreitolu (DTT) w temperaturze 90 (v/v): 5 (v/v): 2,5 (v/v): 2,5 (m/v) przez 4 godziny. Użyj 10 ml dla skali syntezy 100 μmol.
5. Wytrącić rozszczepiony produkt, dodając mieszaninę rozszczepienia do 100 ml lodowatego eteru dietylowego. Przepuścić przez jednostkę filtracyjną zawierającą filtr z politetrafluoroetylenu (PTFE) o wielkości porów 0,45 μm i przemyć 20 ml lodowatego eteru dietylowego.
6. Zebrać przefiltrowany peptyd z bibuły filtracyjnej i rozpuścić 100 mg wytrąconego peptydu w 5 ml destylowanej wody dejonizowanej: acetonitryl w stosunku 1:1.
7. Oczyszczać za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconymi fazami na półpreparatywnej HPLC wyposażonej w porowatą kolumnę polistyrenową diwinylobenzenu o wielkości kulki 10 μm.
   1. Podgrzej kolumnę i utrzymuj ją w temperaturze 50 °C za pomocą urządzenia grzewczego kolumny. Zebrać wszystkie główne frakcje za pomocą automatycznego kolektora frakcji, stosując gradient od 5% do 100% rozpuszczalnika B przez 25 minut przy 4 ml/min.
      nuta: Rozpuszczalnik A to 0,1% TFA w wodzie, a rozpuszczalnik B to 0,1% TFA w acetonitrylu.
   2. Monitorować chromatogram przy długości fali 220 nm, zebrać odpowiednie piki i przeprowadzić analizę przy użyciu chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS).
8. Potwierdzić czystość za pomocą analitycznej ultrawysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (UPLC) z odwróconymi fazami przy długości fali 220 nm, monitorując za pomocą detektora ultrafioletowego (UV) podczas przepuszczania próbki przez analityczną kolumnę C18 (wielkość kulki 1,7 μm). Potwierdzić produkt peptydowy za pomocą spektrometrii mas.
   nuta: UPLC jest sprzężony ze spektrometrią mas z jonizacją elektrorozpylania (ESI-MS) i tandemowym detektorem kwadrupolowym.
9. Liofilizuj odpowiednie frakcje pożądanego peptydu w kolbie okrągłodennej, przykładając próżnię 0,052 mbar do puszystego proszku. Podłączyć pompę próżniową do urządzenia zamrażającego utrzymywanego w temperaturze -78 °C. Przechowywać w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony.
10. Użyj liofilizowanego peptydu, aby przygotować roztwór podstawowy 1 mM w mieszaninie acetonitrylu, DMF i wody analitycznej w stosunku 1:1:1 do eksperymentów. Roztwór ten można przechowywać przez co najmniej 6 miesięcy, ponieważ peptydy nie agregują się w nim.

2. Przygotowanie mieszaniny iniekcyjnej

1. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7,4) do rozcieńczenia liofilizowanych peptydów.
2. Rozpuścić peptyd do końcowego stężenia 20 μM w PBS. Przygotuj ten roztwór na świeżo. Dobrze wymieszać i przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia. Nie należy przekraczać 30 minut, aby zapobiec agregacji w roztworze.

3. Znieczulenie

1. Przygotować roztwór podstawowy środków znieczulających, 0,1% metanosulfonianu etylu m-aminobenzoesanu (MESAB), w zwykłej wodzie dla ryb z układu krążenia. Przygotować roztwór znieczulający do końcowego stężenia 0,0025% (v/v).
2. Wyjmij żądaną liczbę ryb z ich zbiorników do pojemnika transportowego z 5 litrami wody systemowej.
3. Napełnij do połowy plastikową szalkę Petriego (90 mm) 40 ml środków znieczulających. Używaj tego naczynia do wstrzykiwań.
4. Inkubować ryby w środkach znieczulających, aż ruch operkularny ustanie.

4. Mikroiniekcja komorowa mózgu

1. Przygotowanie aparatu iniekcyjnego
   1. Przygotować szklane kapilary iniekcyjne za pomocą ściągacza igłowego o następujących parametrach: cykl nagrzewania, 537; cykl ciągnięcia, 250; prędkość, 1,5 s; czas, 80 ms.
   2. Ustaw ciśnienie w źródle ciśnienia na 25 psi.
   3. Ustaw parametry mikrowtryskiwacza na 20 psi dla wstrzymania i 10 psi dla wyrzutu, 2.5 dla okresu i 100 ms dla bramkowania.
   4. Napełnić szklaną kapilarnę roztworem do wstrzykiwań. Włożyć szklaną kapilę do uchwytu do mikroiniekcji. Ustaw kąt wtrysku na 45°.
2. Umieść jedną rybę na nowej szalce Petriego wypełnionej roztworem znieczulającym.
3. Chwyć rybę kleszczami i ustaw się do wstrzyknięcia.
4. Za pomocą końcówki igły 30 G należy wykonać szczelinę w czaszce nad powierzchnią nerwu wzrokowego, w miejscu, w którym spotykają się dwie boczne płytki. Nie wkładaj końcówki do tkanki mózgowej, może to spowodować krwawienie i uszkodzenie.
5. Włóż szklaną kapilarnę do szczeliny.
   1. Używać tylko końcówki igły i nie przebijać czaszki na więcej niż 1 mm. Trzymaj rybę i włóż końcówkę szklanej kapilary przez miejsce nacięcia.
   2. Ustaw końcówkę szklanej kapilary w kierunku kresomózgowia pod kątem 45°. Wstrzyknąć 1 μl roztworu. Ciecz rozprasza się natychmiast po wstrzyknięciu.

5. Odzyskiwanie

1. Umieść rybę z powrotem w pojemniku transportowym, aż wyzdrowieje. Podłącz pojemnik do regularnie krążącej wody dla ryb, aby zapewnić optymalną jakość wody.
   nuta: Rekonwalescencja powinna zwykle trwać 1 minutę. Jeśli trwa to dłużej, ryba musi być trzymana w znieczuleniu przez krótszy czas (eksperymentator musi to zoptymalizować).

Wyniki

Tabela 1: Sekwencje peptydowe Aβ42 i TR-Aβ42.

powiedział:

peptyd	Sekwencja peptydowa	MW (g/mol)
Aβ42	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA	4514.1
TR-Aβ42	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aminokwasy chronione przez Fmoc	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Niemcy)		Aminokwasy na bazie Fmoc do syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS)
Heksafluorofosforan N,N,N′,N′-tetrametylo-O-(1H-benzotriazol-1-ylo)uron (HBTU)	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Niemcy)	RL-1030	Aktywator
Oksyma (Oxyma)	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Niemcy)	RL-1180	Tłumik racemizacji
N,N-diizopropyloetyloamina	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Niemcy)	SOL-003	baza
Dimetyloformamid	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Niemcy)	SOL-004	rozpuszczalnik
N-metylomorfolina	Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Niemcy	A12158	baza
Hydrat 1-hydroksybenzotriazolu (HOBT)	Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, Stany Zjednoczone)	157260 ALDRICH	Aktywator
Piperydyna	MERCK KGaA (Darmstadt, Niemcy)	822299	Odczynnik deprotekcyjny Fmoc
Dichlormetan (DCM)	MERCK KGaA (Darmstadt, Niemcy)	Numer katalogowy 106050	rozpuszczalnik
Kwas mrówkowy (FA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Niemcy)	100264	Składnik buforowy do HPLC
Kwas trifluorooctowy (TFA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Niemcy)	Numer katalogowy: 808260	Odczynnik do mieszaniny klejącej
Triizopropylosilan (TIS)	MERCK KGaA (Darmstadt, Niemcy)	233781 ALDRICH	Odczynnik do mieszaniny klejącej
Acetonitryl (dla UPLC/LCMS)	Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH	Nr kat. 34967-1L	rozpuszczalnik
Acetonitryl (do HPLC)	VWR International Ltd, Anglia	Numer katalogowy: 83639.32	rozpuszczalnik
Eter dietylowy	VWR International Ltd, Anglia	Numer katalogowy 23811.326	Rozpuszczalnik do wytrącania peptydów
Ditiotrytol (DTT)	VWR International Ltd, Anglia	Numer katalogowy: 0281-25G	Odczynnik do mieszaniny klejącej
TentaGel S RAM Fmoc rink żywica amidowa	Rapp Polymere GmbH (Tybinga, Niemcy)	Zobacz materiał S30023	Faza stała dla SPPS
Synteza peptydów 5 ml strzykawki z dołączonymi filtrami	Intavis AG (Kolonia, Niemcy)	34 274	Rurka reakcyjna do SPPS i do odpływu z fazy stałej
Filtr z politetrafluoroetylenu (PTFE)	Sartorius Stedtim (Aubagne, Francja)	11806-50-N	Filtracja wytrąconych peptydów
Filtr strzykawkowy z polifluorku winylidenu (PVDF)	Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe	Zobacz materiał KC78.1	Filtracja wstępna do HPLC
Syntezator peptydów	Intavis, Kolonia, Niemcy	ResPep SL	Zautomatyzowany syntezator peptydów w fazie stałej
Sojusz wodny HPLC	Waters, Milford, Massachusetts, Stany Zjednoczone	Wody 2998, Wody e2695	Półpreparatywna wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami (HPLC)
PolymerX, wielkość koralików 10μm, 250x10 mm	Phenomenex Sp. z o.o. Niemcy	00G-4328-N0	Porowata kolumna HPLC z polistyrenu diwinylobenzenu
Milli-Q Advantage A10 z filtrem Milli-Q	EMD Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts, Stany Zjednoczone	LCPAK0001	System oczyszczania wody
Jednostka filtrująca	Sartorius Stedtim (Aubagne, Francja)	Numer katalogowy: 16307	Jednostka filtracyjna do wytrącania peptydów
Aquity UPLC z detektorem UV	Waters, Milford, Massachusetts, Stany Zjednoczone	M09UPA 664M	Analityczna ultra HPLC z odwróconymi fazami dla LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, rozmiar koralików 1,7 μm, 50x2,1 mm	Waters, Milford, Massachusetts, Stany Zjednoczone	186002350	Kolumna analityczna C18
Detektor ACQUITY TQ	Waters, Milford, Massachusetts, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał QBB908	Spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylającą (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6	Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Niemcy	16706, 101542	Liofilizator z pompą próżniową
Czytnik płytek Paradigm	Beckman Coulter
MESAB (metanosulfonian etylo-m-aminobenzoesanu)	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5040
Szalki Petriego	Sarstedt	Numer katalogowy: 821.472
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Technologie życiowe, GIBCO	Numer katalogowy: 10010-056
igła	Becton-Dickinson	305178
Mikroskop preparacyjny	Olympus, Leica, Zeiss	Różni się w zależności od producenta
Pęseta Dumont	Światowe instrumenty precyzyjne	501985
Kleszcze preparacyjne Gillies	Światowe instrumenty precyzyjne	501265
Kapilary iniekcyjne szklane	Światowe instrumenty precyzyjne	Zobacz materiał TWF10
Dysza PicoNozzle	Światowe instrumenty precyzyjne	5430-12
Pneumatyczna pompa PicoPump	Światowe instrumenty precyzyjne	SYS-PV820
Oświetlacz pierścieniowy; Przewodnik po lampie pierścieniowej	Naukowy Park	ILL-RLG

powiedział: powiedział: Rozdział powiedział: powiedział: